京尼平修饰的SHH缓释脊髓去细胞支架修复脊髓损伤的实验研究

摘要

脊髓损伤治疗有两大难点：一是神经系统再生能力弱；二是脊髓损伤处会形成胶质瘢痕，从而抑制神经元的再生修复作用。针对以上难点，干细胞/组织工程支架移植是修复脊髓损伤最有前景的治疗手段之一，此策略的主要治疗原理是：①补充脊髓外源性神经干细胞（Neural stem cells, NSCs），在损伤部位修复过程中分化为成熟的神经元细胞，并在损伤部位形成神经接力网络（neural relay circuits）；②改善损伤部位的微环境，为脊髓内在的再生提供良好的微环境，促进脊髓损伤部位的有效修复。 基于上述组织工程修复原理，本研究中构建了可以缓释音猬因子（sonic hedgehog，SHH）的脊髓去细胞支架（acellular spinal cord scaffolds，ASCSs），并用外胚层间充质干细胞（ectomesenchymal stem cells,EMSCs）作为工具细胞在体外验证了其性能；并将京尼平修饰的SHH缓释脊髓去细胞支架移植到大鼠脊髓损伤处，观察其对大鼠脊髓的修复效果。并初步探索了其修复脊髓损伤的机制。为可缓释SHH的脊髓去细胞支架治疗脊髓损伤提供了可能性。相关研究如下： 1.脊髓去细胞支架的制备 取新鲜大鼠脊髓组织，经过化学和物理法联合对脊髓组织行脱细胞处理。脱细胞处理后的脊髓去细胞支架，用HE染色、DAPI染色及琼脂糖凝胶电泳检验其脱细胞效果，结果显示经脱细胞处理后支架几乎不含DNA，证明去核效果好。并用免疫组化检测了支架中含有的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）,结果表明支架中含有Laminin, fibronectin 和 myelin等。并观察脱细胞处理后脊髓组织的形态变化，并用扫描电镜（Scanning electron microscopy, SEM）观察支架的微观结构。 2.京尼平交联脊髓去细胞支架 用京尼平（genipin，GP）交联ASCSs，并进一步摸索了交联作用所需的时间。在不同时间段检测了其交联率，发现了24小时后为交联达到饱和。并检测了交联后支架的体外降解率、孔隙率、溶胀率的改变。结果发现交联后支架降解率降低，孔隙率变化不大，且溶胀率率没有明显变化。 3．SHH缓释支架的构建 将适量SHH加入不同浓度京尼平中预交联，然后将脊髓去细胞支架放入交联，制备生物复合支架（ASCSs-GP-SHH）。ELISA检测其SHH缓释的效果，结果表明SHH可以缓慢释放至少4周。并摸索了京尼平在构建缓释系统的最佳浓度。结果显示5 mg/ml的京尼平为构建缓释体系的最佳浓度。 4．EMSCs的培养及鉴定 取健康SD大鼠鼻粘膜组织，培养原代EMSCs。免疫荧光鉴定其表面标志物，发现EMSCs不但表达间充质干细胞的标志物，同时还高表达神经干细胞的标志物，包括：CD144, CD44, HNK-1, nestin, vimentin和S100等。 5．将EMSCs种植在支架上 将培养的第3-5代EMSCs与上述生物复合支架共培养。MTT法检测显示制备的生物复合支架具有良好的生物相容性。并在支架上将EMSCs诱导分化成神经元样细胞。免疫荧光及Western Blot检测发现诱导后EMSCs表达β-tubulin III， GAP43，MBP， chAT等神经细胞标志物，且GFAP表达明显较其他组少。说明该生物复合支架不仅能诱导EMSCs向神经元样分化，还能抑制EMSCs向胶质细胞分化。 6．支架促进EMSCs的增殖和分化的机制研究 提取诱导分化后细胞的蛋白，通过Western Blot实验方法检测相关通路蛋白表达情况，发现Integrin， Smoothen，Boc等蛋白表达增高，实验证明支架促进EMSCs的增殖和分化是通过Integrins，Smoothened和 BOC通路。 7．评价缓释SHH的脊髓去细胞支架（SHH-GP-ASCSs）促进大鼠SCI修复的效果 将SHH-GP-ASCSs移植到大鼠脊髓损伤处。术后每周记录大鼠双后肢功能活动（BBB评分），发现SHH-GP-ASCSs可以促进大鼠双后肢功能活动的恢复。术后12周取出脊髓组织，采用免疫组织化学染色和Western Blot检测，实验发现移植SHH-GP-ASCSs组脊髓损伤附近的两端Nestin， GAP43， NF200， MBP蛋白表达增高，且GFAP表达量减少。说明SHH-GP-ASCSs通过募集内源性神经干细胞到脊髓损伤处，并促进其分化神经细胞，并通过抑制胶质瘢痕的生成来修复大鼠SCI。

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绪 论

第一节 可缓释SHH脊髓去细胞支架的构建

1 试验材料

1.1 实验动物

1.2 试验仪器

1.3 试验试剂

1.4 工作液配制

2 实验方法

2.1 脊髓去细胞支架的制备

2.2 制备的脊髓去细胞支架的鉴定

2.3 统计处理

3 结果

3.1 脊髓去细胞支架的测定结果

3.2 京尼平交联的脊髓去细胞支架

3.3 ASCSs-GP-SHH的缓释性能

第二节 外胚层间充质干细胞的分离、培养和鉴定

1 实验材料

1.1实验仪器

1.2实验试剂与药品

1.3主要工作液配制

2实验方法

2.1 外胚层间充质干细胞的获取及原代培养

2.2 MTT检测细胞增殖能力

2.2 免疫荧光检测EMSCs的表面标记物

3 结果

3.1 EMSCs的原代形态学观察

3.2 EMSCs的细胞生长曲线

第三节 ASCSs-GP-SHH对EMSCs增殖与分化的影响

1实验器材

1.1 实验仪器

1.2 实验试剂

1.3 主要工作液配制

2实验方法

2.1 MTT检测ASCSs-GP-SHH对EMSCs增殖的影响

2.2 免疫荧光和Western blot法检测ASCSs-GP-SHH对EMSCs分化的影响

2.3 统计处理

3 结果

3.1 各组支架与EMSCs的体外生物相容性

3.2 ASCSs-GP（5 mg/ml）-SHH对EMSCs的诱导分化

第四节 大鼠脊髓损伤模型的构建

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 实验器材

2 实验方法

3. 结果

第五节 观察移植ASCSs-GP-SHH对大鼠SCI的修复效果

1实验材料

1.1 实验仪器

1.2实验试剂与药品

1.3主要工作液配制

2实验方法

2.1 ASCSs-GP-SHH对大鼠脊髓损伤下肢功能恢复的影响

2.2 Western blot法检测脊髓损伤修复效果

2.3免疫组织化学染色法检测脊髓损伤修复效果

3结果

3.1 大鼠后肢运动功能评分

3.2 脊髓损伤平面组织形态学分析

3.3 脊髓组织内相关分子的蛋白表达水平检测

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

攻读硕士期间发表学术论文