蛋氨酸的瘤胃代谢与调控研究

摘要

蛋氨酸是动物的必需氨基酸，对于单胃动物而言，提高日粮蛋氨酸供给可满足其对蛋氨酸的需要。然而，反刍动物由于瘤胃微生物的降解，通过日粮直接增加蛋氨酸的供给量并不能显著改善动物对蛋氨酸的需要。包被蛋氨酸和基团修饰蛋氨酸虽然可以克服蛋氨酸的瘤胃降解，但处理成本较高。为此，本研究探讨蛋氨酸瘤胃降解代谢过程中与有关酶的关系及其影响因素等，为寻求经济有效的瘤胃蛋氨酸降解的生物学调控方法提供理论依据。 1．瘤胃液转氨酶的变化规律研究：于晨饲前和晨饲后1 h从装有永久性瘤胃瘘管的3只山羊瘤胃吸取瘤胃液并分别装瓶、去除饲料颗粒，然后将每只羊饲喂前后的瘤胃液分装至3个血清瓶中，每瓶20mL，同时每瓶加淀粉20mg。每只羊每次采集后分装的3瓶瘤胃液随机进行3种处理，分别加入0.1mol/L蛋氨酸10mL(蛋氨酸组)、0.1mol/L赖氨酸10mL(赖氨酸组)和去离子水10mL(对照组)，于培养的0、8和16 h取培养液测定GOT和GPT。结果表明，饲喂前的瘤胃液GPT活性随培养时间的延长而降低，而饲喂后的瘤胃液则相反。饲前瘤胃液添加蛋氨酸培养8 h的GPT和GOT活性较对照组和赖氨酸组升高，饲后瘤胃液添加赖氨酸或蛋氨酸的GPT和GOT活性均较对照组增强。结果提示，瘤胃液的采集时间和底物的赖氨酸或蛋氨酸含量均影响培养液中GOT和GPT‘活性。 2．蛋氨酸含量变化与有关代谢酶的相关关系：三只羊瘤胃液混匀后分装至12个血清瓶中，每瓶40mL，随机分成蛋氨酸组和对照组，每组6瓶，两组每瓶再分别添加0.25mol/L L-蛋氨酸和去离子水8mL。于培养的0、8h和16 h取培养液测定GDH、Y-GT、 GOT、 GPT、UN和游离蛋氨酸。结果表明，对照组的16 h GPT与16 h GOT和16 h蛋氨酸浓度分别是极显著和显著正相关(r=0.95，r=0.86)，0 h蛋氨酸含量与16 h的含量显著负相关(r=-0.83)；蛋氨酸组的16 h GDH与16 h蛋氨酸浓度极显著正相关(r=0.94)， 0 h蛋氨酸与8 h GDH显著负相关(r=-0.86)，16 h蛋氨酸与8 h GPT显著正相关(r=0.88)。结果提示： GDH在蛋氨酸的降解代谢过程中可能是通过催化谷氨酸的合成在氨基酸的代谢中起着重要的调节作用，蛋氨酸在混合瘤胃微生物中的降解与GDH显著相关。 3．离子载体对蛋氨酸代谢的影响：利用三只装有永久性瘤胃瘘管的山羊采用三重复自身对比设计比较了MHA和不同水平拉沙里菌素对瘤胃液和血液中游离蛋氨酸、GDH、γ-GT、GOT、GPT、UN的影响。分期进行测定，每期6天，第一期饲喂基础草料(对照期)，第二期和第三期在饲喂对照料的基础上再添加蛋氨酸和拉沙里菌素，只是两期拉沙里菌素投饲量不同(23mg/d和30mg/d)，第四期饲喂对照期日粮，第五期投饲MHA(18.75g/)，然后于各期的最后一天晨饲前、饲喂后2 h和5 h分别采集试羊瘤胃液和血液测定游离Met、GDH、γ-GT、GOT、GPT和UN。结果表明，与对照组和MHA组相比，拉沙里菌素可显著提高瘤胃液中的游离蛋氨酸含量(P<0.01)和降低GPT的活性(P<0.05)，使血清游离蛋氨酸浓度升高和γ-GT活性增强(P<0.05)，可显著提高饲前血清中GDH活性。MHA饲喂2 h后血清游离蛋氨酸浓度显著升高(P<0.05)。结果提示，拉沙菌素可通过抑制GPT、调节DGH等的协同作用限制蛋氨酸的瘤胃降解，具有瘤胃微生物利用蛋氨酸的功能。 4．蛋氨酸或赖氨酸作为惟一氮、碳对瘤胃微生物氨基酸代谢的影响：将瘤胃后分装至9个含维生素和矿物质培养基100札、瘤胃液5 mL的血清瓶中，然后被随机分成3组，即对照组、蛋氨酸组和赖氨酸组，每组3瓶。对照组不加任何氨基酸，蛋氨酸组和赖氨酸组每瓶分别注入1 mL 0.1 mmol/L L-蛋氨酸和1 mL 0.1mmol/L L-赖氨酸。于培养的0、8和16 h取培养液测定GOT、GPT和游离氨基酸。结果表明，以蛋氨酸作为氮源和碳源时，使产物中游离Gly增加，使培养16 h培养液中的游离组氨酸(His)含量提高(P<0.05)，缬氨酸(Val)迅速消耗殆尽。当以赖氨酸作为氮源和碳源时培养液中His含量降低(p<0.01)，同时可提高甘氨酸(Gly)含量(p<0.05)。结果提示，Val、Cys-s、Ser和His可能对以蛋氨酸为惟一氮源和碳源的瘤胃微生物是十分重要的氨基酸。His可能是以赖氨酸为唯一氮源和碳源瘤胃微生物生长的重要氨基酸。 5．瘤胃蛋氨酸降解菌的分离及其16S rDNA全序列分析：对山羊瘤胃液中经分离纯化得到的一株蛋氨酸降解菌MB6-1，采用PCR方法扩增出16S rDNA基因，并测定其基因的核苷酸全序列，基于16S rDNA序列的同源性比较和系统发育学分析，发现MB6-1可能是普罗威登斯菌属(Providencia)中的一个新种。菌株MB6-1的16S rDNA序列已经被GenBank数据库收录，其序列号为DQ436917。 综上所述，瘤胃液的采集时间和底物的氨基酸类型均影响体外培养液中GOT和GPT活性。蛋氨酸在混合瘤胃微生物中的降解与GDH显著相关。在氮源缺乏的条件下，瘤胃微生物可能通过γ-GT、GPT和GOT的共同作用增加尿素氮的积累，以维持生长。拉沙里菌素可通过抑制GPT、调节DGH等的协同作用限制蛋氨酸在瘤胃被利用，具有抑制瘤胃微生物利用蛋氨的功能。Val、Cys-s、Ser和His可能对以Met为惟一氮源和碳源的瘤胃微生物是十分重要的氨基酸。His可能是以Lys为唯一氮源和碳源的瘤胃微生物生长的重要氨基酸。MB6-1可能是普罗威登斯菌属(Providencia)中的一个新种。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

第一章绪论

1.1引言

1.2蛋氨酸的生理功能

1.3瘤胃微生物的蛋氨酸代谢

1.4影响瘤胃微生物与氨基酸代谢的因素

1.5瘤胃发酵的调控

1.5.1通过调整饲粮和改变饲喂方式的调控

1.5.2选择天然过瘤胃蛋白增加到达小肠的必需氨基酸

1.5.3蛋氨酸瘤胃保护的物理方法

1.5.4蛋氨酸瘤胃保护的化学方法

1.5.5利用添加剂调节瘤胃发酵

1.5.6利用生物技术进行调控

1.6 16S rDNA序列分析技术在瘤胃细菌微生态系统研究中的应用

1.7蛋氨酸瘤胃代谢调控的展望

1.8立题意义与本课题主要研究内容

参考文献

第二章瘤胃液转氨酶的变化规律研究

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1主要试剂

2.2.2 MAT的引物

2.2.3主要仪器

2.2.4试验方案

2.2.5试验动物

2.2.6试验日粮

2.2.7试验动物饲养管理

2.2.8瘤胃液采集与去饲料颗粒

2.2.9测定项目与方法

2.2.10MAT测定步骤

2.2.11数据处理

2.3结果与分析

2.3.1饲喂前后瘤胃液中GOT和GPT的变化

2.3.2添加氨基酸后培养液中GOT和GPT的变化

2.4讨论

2.4.1饲喂前后瘤胃液中GOT和GPT的变化

2.4.2添加氨基酸后培养液中GOT和GPT的变化

2.4.3蛋氨酸腺苷转移酶

2.5小结

参考文献

第三章蛋氨酸含量变化与有关代谢酶的相关关系

3.1前言

3.2材料和方法

3.2.1主要试剂

3.2.2主要仪器

3.2.3试验方案

3.2.4试验动物及其日粮与饲养管理、瘤胃液的采集

3.2.5采样与样品制备

3.2.6测定项目与方法

3.2.7蛋氨酸消化率计算

3.2.8数据处理

3.3结果与分析

3.3.1添加蛋氨酸在不同发酵时间对蛋氨酸代谢的影响

3.3.2蛋氨酸浓度和培养时间对蛋氨酸代谢的影响

3.3.3蛋氨酸、GDH、γ-GT、GPT、GOT和UN间的相关

3.3.4蛋氨酸的消化率

3.4讨论

3.4.1添加蛋氨酸在不同发酵时间的影响

3.4.2底物氨基酸与发酵时间的影响及两因素之间的互作效应

3.4.3蛋氨酸、GDH、γ-GT、GPT、GOT和UN间的相关

3.4.4蛋氨酸的消化率

3.5小结

参考文献

第四章离子载体对蛋氨酸代谢的影响

4.1前言

4.2材料与方法

4.2.1主要试剂

4.2.2主要仪器

4.2.3试验方案

4.2.4试验动物及其日粮与饲养管理、瘤胃液的采集

4.2.5采样与样品制备

4.2.6测定项目与方法

4.2.7数据处理

4.3结果与讨论

4.3.1对照组晨饲前后部分生化指标的变化

4.3.2补饲Met+0.15g拉沙里菌素后部分生化指标的变化

4.3.3补饲Met+0.20g拉沙里菌素后部分生化指标的变化

4.3.4补饲MHA后部分生化指标的变化

4.3.5各处理组在不同时间血液部分生化指标的变化

4.3.6各处理组在不同时间瘤胃液部分生化指标的变化

4.4小结

参考文献

第五章蛋氨酸或赖氨酸作为惟一氮、碳源对瘤胃微生物氨基酸代谢的影响

5.1前言

5.2材料与方法

5.2.1主要试剂

5.2.2主要仪器

5.2.3试验动物、饲草饲料、饲养管理及瘤胃液采集

5.2.4培养基的配制

5.2.5接种瘤胃微生物

5.2.6取样与测定

5.2.7数据处理

5.3结果与分析

5.3.1不同培养时间GOT、GPT和氨基酸的变化结果

5.3.2不同氮源和碳源对GOT、GPT和氨基酸的影响结果

5.4讨论

5.5小结

参考文献

第六章瘤胃蛋氨酸降解菌的分离及其16S rDNA全序列分析

6.1前言

6.2材料和方法

6.2.1主要试剂

6.2.2主要仪器

6.2.3试验方案

6.2.4试验动物及其日粮配方、饲养管理和瘤胃液的采集

6.2.5试剂配制

6.2.6分离、培养

6.2.7总DNA提取

6.2.8 16s rDNA的PCR扩增

6.2.9 PCR产物电泳

6.2.10胶回收

6.2.11感受态细胞制备

6.2.12连接和转化

6.2.13阳性克隆的筛选与鉴定

6.2.14序列测定

6.2.15序列注册号

6.2.16碱基序列分析资料

6.3结果

6.3.1分离培养

6.3.2 MB6-1菌株16S rDNA序列测定

6.4讨论

6.5小结

参考文献

论文主要结论

论文主要创新点

博士研究生期间发表的学术论文及鉴定的研究成果

致谢