甘油合成关键酶基因CgGPD1在大肠杆菌和产甘油假丝酵母中的表达

摘要

甘油是一种重要的轻化工原料，已广泛应用于化妆品、牙膏、烟草、香精、水性油墨、印染纺织、涂料、合成树脂、皮革、造纸、制药、食品和国防等十多个领域的1700多种产品。发酵法生产甘油与甘油的其它生产方法相比有着特有的优势。耐高渗产甘油假丝酵母WL2002-5是本研究室拥有自主知识产权的甘油生产菌株，是迄今为止国内外报道的生产性状最优良的甘油生产菌株，其发酵生产甘油具有高产量、高转化率和高回收率等优点，已经应用于大规模的发酵甘油工业生产中。 胞浆3-磷酸甘油脱氢酶是酵母甘油合成的关键酶，有研究表明，提高甘油合成的最直接的办法就是过量表达编码3-磷酸甘油脱氢酶GPDH的同工酶Gpd1的基因GPD1。在前期研究的基础上，本文采用PCR的方法扩增了产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因及侧翼序列CgGPD1，构建了含CgGPD1基因不同拷贝数的根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1，pCAM3300-zeocin-CgGPD1-CgGPD1和pCAM3300-zeocin-CgGPD1-CgGPD1-CgGPD1，并将其转入大肠杆菌JM109中，初步研究了其在不同浓度NaCl、葡萄糖胁迫下表达情况。 由于产甘油假丝酵母是工业生产菌株，其在细胞壁结构上的特殊性等原因使得常规的酵母转化方法转化效率很低。为此本文将构建的含CgGPD1基因不同拷贝数根癌农杆菌双元载体电击转入根癌农杆菌LBA4404中，利用根癌农杆菌介导转化的方法将单拷贝CgGPD1成功转入产甘油假丝酵母中，得到含CgGPD1基因的产甘油假丝酵母转化子并命名为Candidaglycerinogenes-CgGPD1(C.g-G)。 通过筛选得到一株高产甘油的产甘油假丝酵母转化子C.g-G8，实验表明CgGPD1全长基因的插入并没有改变C.g-G8的生长过程，转化子C.g-G8的平均耗糖速率明显对原始菌株C.g要快，CgGPD1全长基因的整合在一定程度上提高产甘油假丝酵母甘油产量，其甘油产量比原始菌株提高了12.08％；其甘油发酵时间比原始菌株发酵时间缩短6h；其甘油合成速率比原始菌株提高了20.49％。C.g-G8在发酵过程中Gpd1p酶活也维持在较高的水平，转化子的平均酶活比原始菌株的平均酶活提高27.55％，这说明通过根癌农杆菌介导转化的方法将CgGPD1全长基因转入产甘油假丝酵母并进行了有效的表达。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1甘油的性质及研究现状

1.1.1甘油的理化性质及主要用途

1.1.2甘油的生产方法

1.1.3发酵法生产甘油

1.2产甘油假丝酵母的研究进展

1.3甘油的合成途径

1.4 3-磷酸甘油脱氢酶及其研究现状

1.5酵母转化的研究进展

1.6根癌农杆菌介导的酵母遗传转化

1.6.1根癌农杆菌介导酿酒酵母遗传转化机理

1.6.2根癌农杆菌Ti质粒载体系统的发展

1.6.3转基因酵母的遗传表达

1.6.4影响根癌农杆菌介导转化转化率的主要因素

1.7本研究的立题背景和内容

第二章产甘油假丝酵母甘油合成关键酶基因CgGPD1多拷贝表达载体的构建

2.1材料与方法

2.1.1菌株和质粒

2.1.2工具酶与试剂

2.2.3主要仪器

2.1.4培养基

2.1.5 PCR引物

2.1.6产甘油假丝酵母染色体DNA的制备

2.1.7 PCR扩增反应体系及反应条件

2.1.8 PCR产物胶回收

2.1.9大肠杆菌感受态细胞的制备

2.1.10转化大肠杆菌

2.1.11质粒DNA的提取

2.1.12A.tumefaciens LBA4404感受态的制备

2.1.13电击转化A.tumefaciens LBA4404

2.1.14 A.tumefachins LBA4404的质粒提取

2.1.15 CgGPD1与pMD-18Tvector的连接

2.1.16单拷贝表达载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1的构建

2.1.17双拷贝表达载体pCAM3300-zeocin-CgrGPD1-CgGPD1的构建

2.1.18三拷贝表达载体pCAM3300-zeocin-CgrGPD1-CgGPD1-CgGPD1的构建

2.2结果

2.2.1 CgGPD1基因的PCR扩增

2.2.2 pMD-18T-CgGPD1的构建

2.2.3单拷贝表达载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1的验证

2.2.4双拷贝表达载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1-CgGPD1的验证

2.2.5三拷贝表达载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1-CgGPD1-CgGPD1的验证

2.2.6电击转化A.tumefaciens LBA4404

2.3本章小结

第三章产甘油假丝酵母甘油合成关键酶基因CgGPD1在大肠杆菌中的表达研究

3.1材料与方法

3.1.1菌株和质粒

3.1.2工具酶与试剂

3.1.3培养基

3.2.3主要仪器

3.1.4大肠杆菌感受态细胞的制备

3.1.5大肠杆菌的转化

3.1.6含CgGPD1不同拷贝数根癌农杆菌双元载体转化大肠杆菌JM109

3.1.7 JM109(Ⅰ)、JM109(Ⅱ)、JM109(Ⅲ)在不同浓度NaCl条件下培养

3.1.8 JM109(Ⅰ)、JM109(Ⅱ)、JM109(Ⅲ)在不同葡萄糖浓度条件下培养

3.1.9 GPDH粗酶液的制备

3.1.9 3-磷酸甘油脱氢酶酶活测定

3.1.10蛋白质含量测定

3.2结果

3.2.1不同浓度NaCl对CgGPD1表达的影响：

3.2.1不同浓度葡萄糖对CgGPD1表达的影响：

3.3本章小结

第四章根癌农杆菌介导CgGPD1转化产甘油假丝酵母及其转化子的初步发酵实验

4.1材料与方法

4.1.1菌株和质粒

4.1.2工具酶和试剂

4.2.3主要仪器

4.1.3培养基

4.1.4根癌农杆菌电击转化

4.1.5根癌农杆菌Ti质粒转化产甘油假丝酵母

4.1.6产甘油假丝酵母阳性转化子表型验证

4.1.7产甘油假丝酵母阳性转化子染色体提取和PCR验证

4.1.8产甘油假丝酵母阳性转化子稳定性验证

4.1.9转化子发酵产甘油能力筛选

4.1.10发酵过程参数分析

4.1.11转化子生长曲线测定

4.1.12发酵液中甘油含量的测定

4.1.13残糖测定

4.1.14生物量的测定

4.1.15粗酶液的制备

4.1.16胞浆3-磷酸甘油脱氢酶酶活测定

4.1.17酶蛋白含量测定

4.2结果与讨论

4.2.1产甘油假丝酵母阳性转化子获得

4.2.2产甘油假丝酵母转化子的PCR验证

4.2.3产甘油假丝酵母转化子的稳定性验证

4.2.4高产甘油阳性转化子的筛选

4.2.5 CgGPD1的插入对菌株生长的影响

4.2.6转化子C.g-G8发酵参数的时序变化

4.2.7转化子C.g-G8发酵过程中GPDH酶活的变化

4.2.8讨论

4.3本章小结

主要结论

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文