脱氧雪腐镰刀烯醇超微量免疫检测法的建立

摘要

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)污染粮食作物的现象非常普遍，广泛存在于大麦、玉米、小麦等农作物。目前，世界范围内DON污染居各种生物毒素之首，属于严重污染。本研究主要目的采用时间分辨荧光免疫分析(Time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)技术建立检测DON高灵敏的分析技术。论文的主体部包括以Eu3+为标记物建立DON-TRFIA免疫检测法及Eu3+/Sm3+为标记物建立DON/ZEN双标记TRFIA。首先建立DON-TRFIA免疫检测法并对其进行严格的考核。DON-TRFIA灵敏度为0.01ng/mL，检测范围为0.01～100ng/mL，批内、批间变异率均<10%。不同样品的添加回收率符合免疫分析方法平均回收率在70%～130%之间。玉米样品检测结果表明DON-TRFIA与商品化DON-ELISA试剂盒结果高度相关。在DON-TRFIA工作的基础上，以Eu3+/Sm3+为标记物建立了快速、灵敏、可靠的DON/ZEN双标记TRFIA。双标记DON/ZEN-TRFIA的灵敏度为:DON为0.194ng/mL、ZEN为0.73ng/mL。测量范围为:DON0.194～100ng/mL、ZEN0.73～50ng/mL。最后初步建立了DON光激化学发光免疫检测法(DON-LICLIA)，并简要的考核DON-LICLIA的稳定性、样品添加回收率等。DON-LICLIA两步共30min的反应模式缩短了检测时间，批内批间变异率均<5%。检测范围为0.007～100ng/mL，灵敏度为0.007ng/mL。
　　 研究表明，DON-TRFIA是目前已报道文献中最灵敏的DON免疫检测法，具有很好的应用前景。本论文对DON的TRFIA以及新兴的光激化学发光检测技术进行了比较全面的探讨，为我国这一领域以及相关领域的研究提供了有价值的参考资料。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词

声明

1 引言

1.1 DON简介

1.1.1 DON理化性质

1.1.2 DON毒性作用

1.2 DON限量标准

1.3 DON的检测法及其局限

1.3.1 DON的物理检测法

1.3.2 免疫分析技术

1.4 时间分辨荧光免疫检测

1.5 多标记免疫检测

1.6 光激化学发光免疫检测

1.7 立题目的、意义和研究内容

1.7.1 目的和意义

1.7.2 研究内容

2 实验材料与方法

2.1 主要试剂

2.2 主要仪器

2.3 实验方法

2.3.1 间接竞争DON-TRFIA的建立方法

2.3.2 DON时间分辨荧光免疫试剂盒的研制与考核方法

2.3.3 呕吐毒素/玉米赤酶希酮双标记TRFIA的建立方法

2.3.4 DON光激化学发光免疫检测法的建立方法

3 结果与讨论

3.1 间接竞争DON-TRFIA的建立

3.1.1 Eu3+-羊抗兔IgG标记的鉴定

3.1.2 96孔微孔板的选择

3.1.3 DON PcAb的稀释实验

3.1.4 Eu3+-羊抗兔IgG浓度的确定

3.1.5 包被抗原浓度的选择

3.1.6 反应动力学考察结果

3.1.7 不同标准品稀释液对检测结果的影响

3.1.8 DON-TRFIA标准曲线的绘制

3.2 DON-TRFIA试剂盒的研制与考核

3.2.1 精密度

3.2.2 灵敏度和工作范围

3.2.3 稳定性

3.2.4 添加回收率

3.2.5 健全性考核

3.2.6 方法学比较

3.3 呕吐毒素/玉米赤酶希酮双标记TRFIA的建立

3.3.1 标准的配制

3.3.2 Sm3+-羊抗鼠IgG的纯化

3.3.3 抗体稀释比的确定

3.3.4 包被抗原浓度的确定

3.3.5 Sm3+-羊抗鼠IgG稀释比的确定

3.3.6 DON/ZEN双标记TRFIA反应动力学

3.3.7 DON/ZEN双标记TRFIA标准曲线

3.3.8 双标记方法学考核

3.4 DON光激化学发光免疫检测法的建立

3.4.1 DON人工抗原-发光微粒与DON多克隆抗体工作浓度的选择

3.4.2 生物素化羊抗兔IgG稀释度的确定

3.4.3 不同温度下的竞争反应时间的确定

3.4.4 连有链霉亲合素的感光微粒反应温度、时间的确定

3.4.5 缓冲液中BSA浓度的确定

3.4.6 缓冲液pH的确定

3.4.7 缓冲液离子强度的确定

3.4.8 DON-LICLIA标准曲线的绘制

3.4.9 添加回收试验

3.4.10 方法学比较

4 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

致 谢

参考文献

附录：攻读硕士学位期间发表的论文及申请的专利