绿色木霉产非专一性水解壳聚糖的纤维素酶研究

摘要

酶解法制备壳寡糖所用的酶一般分为专一性酶和非专一性酶，绿色木霉纤维素酶是非专一性酶中的一种优良酶制剂。该酶可水解壳聚糖得到聚合度为5～8的高生物活性的壳寡糖，因此采用绿色木霉发酵获得纤维素酶，并用于制备高活性壳寡糖。
　　 本文以产酸性纤维素酶菌株绿色木霉Trichoderma viride Y-19为出发菌株(壳聚糖酶活为0.2001U/mL)，经紫外线、亚硝基胍(NTG)多次诱变和自然筛选相结合的方法，筛选到一株遗传特性稳定的高产突变菌株XY-131。此突变株的壳聚糖酶活提高到0.403IU/mL。
　　 对绿色木霉XY-131产纤维素酶的摇瓶发酵培养基及发酵条件进行了优化，在单因素试验基础上，利用响应面方法，并借助Design Expert7.1.3软件对数据进行统计分析，得到最佳发酵培养基为:Avicel2.56%，玉米芯1.03%，棉籽饼粉4.79%，麸皮0，5%，KH2PO40，2%，(NH4)2SO40.2%，CaCl20.03%，MgSO40.03%。并确定了其摇瓶发酵条件:初始pH5.5，温度30℃，接种量10%(v/v)，装液量75mL/250mL，转速160r/min，培养48h后加入0.1g/100mL的Tween-60。优化后酶活可达到2.38IU/mL。在此基础上，用30L发酵罐进行放大试验，30℃培养5天，测得的壳聚糖酶活为2.68IU/mL。
　　 采用板框过滤、超滤浓缩、无水乙醇沉淀和冷冻干燥，对发酵液进行了提取浓缩。固体酶总收率为41%，液体浓缩壳聚糖酶活达到14.06IU/mL，固体酶活为130.04IU/g。
　　 对酶学性质作了初步研究，水解壳聚糖的最适pH为5.0，最适反应温度为60℃；pH为4.0～5.0，温度低于50℃时，酶较稳定；Mn2+、Co2+和Mg2+对酶活有一定的激活作用，Fe2+对酶活有一定的抑制作用，Zn2+、K+、Ba2+、Ca2+对酶活没有明显的影响。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 引言

1.1 壳聚糖与壳寡糖

1.1.1 壳聚糖简介

1.1.2 壳寡糖应用

1.1.3 壳聚糖的酶法降解

1.2 纤维素酶发酵生产

1.2.1 固体发酵产酶

1.2.2 液体发酵产酶

1.3 纤维素酶产生菌的诱变选育

1.4 本课题的研究背景和意义

1.5 本课题研究的内容

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种

2.1.2 主要试剂与药品

2.1.3 培养基

2.1.4 主要实验设备

2.2 实验方法

2.2.1 绿色木霉的液体发酵培养方法

2.2.2 壳聚糖酶活(Chitosanase)测定及酶活力单位定义

2.2.3 CMCase酶活测定及酶活力单位定义

2.2.4 致死率的计算

2.2.5 产纤维素酶菌株的筛选

2.2.6 发酵条件优化及30L发酵罐放大试验

2.2.7 酶提取工艺

2.2.8 酶学性质

第三章 结果与讨论

3.1 筛选平板的确定

3.2 产纤维素酶菌株的筛选

3.2.1 紫外线的最佳辐射剂量的选择

3.2.2 亚硝基胍最佳剂量的选择

3.2.3 紫外线诱变的结果

3.2.4 亚硝基胍(NTG)诱变的结果

3.2.5 亚硝基胍与紫外线复合诱变的结果

3.2.6 诱变高产突变菌株的自然筛选

3.2.7 产酶稳定性实验

3.3 摇瓶发酵条件优化

3.3.1 碳源对产酶的影响

3.3.2 氮源对产酶的影响

3.3.3 KH2PO4对产酶的影响

3.3.4 麸皮对产酶的影响

3.3.5 MgSO4和CaCl2对产酶的影响

3.3.6 响应面试验分析确定最适培养基

3.3.7 其它培养条件对产酶的影响

3.3.8 优化后摇瓶培养的发酵过程曲线

3.4 30L罐放大试验

3.5 酶提取工艺

3.6 酶学性质

3.6.1 温度对酶活的影响

3.6.2 pH对酶活的影响

3.6.3 酶的热稳定性

3.6.4 酶的pH稳定性

3.6.5 金属离子对酶活的影响

3.7 结论

3.8 讨论

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文