地衣芽孢杆菌原生质体的制备、再生及转化研究

摘要

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是芽孢杆菌中最具应用潜力的菌种之一，被广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染治理等各个行业。地衣芽孢杆菌野生菌株的性能通常不能满足生产需要，因此需要对其进行遗传改造。将外源DNA片段成功导入地衣芽孢杆菌细胞是对宿主进行分子操作和遗传研究的前提和基础，而原生质体转化方法是芽孢杆菌遗传转化的主要手段之一。由于不同地衣芽孢杆菌菌株的原生质体形成、再生、转化差异较大，因此需要对其影响因素进行优化。地衣芽孢杆菌B。licheniformis303是一株优良的地衣芽孢杆菌宿主菌。本论文以B.licheniformis303为宿主，系统考察了影响该菌原生质体形成、再生的因素，初步优化了B.lichenjormis303原生质体转化方法，为进一步的分子操作奠定了基础。
　　 本文研究了B.licheniformis303菌体生长状态、溶菌酶使用浓度和作用时间、渗透压稳定剂和再生培养基等因素对B.licheniformis303原生质体制备及再生的影响，优化了原生质体的制备和再生条件。结果表明:以转接培养至对数生长后期即8h的菌体，pH6.5的SMMP作为渗透压稳定剂，溶菌酶浓度为100mg/mL，酶解温度为37℃，摇床转速为100r/min，酶解时间为40min时，可获得最高原生质体制备率为8.0×109个/mL；当再生培养基DM3中添加1mol/L琥珀酸钠时，原生质体再生率可达到17%。
　　 在此基础上，本文对影响B.licheniformis303原生质体转化效率的主要因素进行了研究，考察了原生质体浓度、质粒浓度、Mg2+浓度、后培养方式等因素对转化率的影响。结果表明:以2μg甲基化质粒pHY-P43-secQ，40%PEG6000+20mmol/LMg2+为融合剂，原生质体浓度为3×109个/mL，处理5min，后培养方式为30℃，100r/min培养150min，平均转化率为15CFU/μgDNA。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

1.1 地衣芽孢杆菌

1.1.1 地衣芽孢杆菌的一般生物学特性

1.1.2 地衣芽孢杆菌的主要应用

1.2 原生质体转化技术概述

1.2.1 原生质体

1.2.2 原生质体转化技术

1.2.3 影响原生质体转化效率的主要因素

1.2.4 原生质体转化技术的研究进展

1.3 本论文的立题依据和研究内容

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 主要生化与分子生物学试剂

2.1.3 培养基与试剂

2.1.4 主要仪器与设备

2.2 方法

2.2.1 菌种活化

2.2.2 B.licheniformis 303生长曲线测定

2.2.3 原生质体的制备

2.2.4 原生质体的再生

2.2.5 质粒的提取

2.2.6 原生质体转化

2.2.7 转化子鉴定

第三章 结果与讨论

3.1 B.licheniformis 303生长曲线测定

3.2 原生质体制备条件的优化

3.2.1 菌体生长状态对原生质体形成的影响

3.2.2 溶菌酶浓度对原生质体形成的影响

3.2.3 酶解时间对原生质体形成的影响

3.2.4 酶解温度对原生质体形成的影响

3.2.5 渗透压稳定剂对原生质体形成的影响

3.2.6 渗透压稳定剂pH对原生质体形成的影响

3.2.7 原生质体形成的显微观察

3.3 原生质体再生条件的优化

3.3.1 酶解时间对原生质体再生的影响

3.3.2 再生培养基对原生质体再生的影响

3.3.3 渗透压稳定剂对原生质体再生的影响

3.3.4 原生质体的贮存对再生率的影响

3.4 原生质体转化条件的优化

3.4.1 原生质体对四环素的抗性敏感性

3.4.2 质粒pHY—P43—secQ的提取

3.4.3 原生质体浓度对转化的影响

3.4.4 质粒浓度对转化的影响

3.4.5 PEG分子质量及其质量浓度对转化的影响

3.4.6 PEG处理时间对转化的影响

3.4.7 融合剂中无机阳离子对转化的影响

3.4.8 融合剂中不同浓度Mg2+对转化的影响

3.4.9 后培养方式对转化的影响

3.4.10 质粒大小对转化的影响

3.4.11 质粒不同处理方式对转化的影响

3.5 转化子的鉴定

3.6 小结

论文主要结论

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文