聚唾液酸修饰铜锌超氧化物歧化酶的研究

摘要

聚唾液酸(PSA)是唾液酸单体以α-2,8或/和α-2,9糖苷键连接起来的线性聚合物,具有强亲水性、生物可降解性和很好的生物相容性。因其更有效的安全性,聚唾液酸被公认为传统药物缓释材料聚乙二醇(PEG)的理想替代材料。聚唾液酸修饰又称为聚唾液酸化(polysialylation),即在蛋白质或多肽类药物表面通过化学交联的形式共价连接聚唾液酸,以提高蛋白质或多肽类药物的稳定性和药理学效能。
　　 为了使聚唾液酸纯度满足药用需求,本论文在原有粗品聚唾液酸提纯工艺的基础上,进一步延伸了聚唾液酸的纯化工艺。发酵液经离心、乙醇沉淀、碱性沉淀和氯代十六烷基吡啶(CPC)络合处理得到纯度为90％左右的聚唾液酸粗品,粗品溶解后再经超滤(100kDa)和DEAE F F离子交换层析和Scphacryl S-200 HR凝胶层析处理,得到高纯度聚唾液酸样品,累积回收率9.59％。该工艺得到的聚唾液酸蛋白质含量为2.12×104mg/mg PSA,内毒素去除率大于99.8％,经HPGFC分析,纯度为99.71％,峰均相对分子量为16.2kDa,各种指标均已达到医药级水平,可用于聚唾液酸化修饰药用蛋白。
　　 本文选用铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)作为聚唾液酸修饰的靶向蛋白,初步测定其原始酶活为17.6×104NU/mg protein,经SDS-PAGE电泳分析,呈电泳纯,分子量为32kDa。
　　 分别以高纯度聚唾液酸和CuZn-SOD为糖链供体和靶向蛋白,本文建立了一条完整高效的聚唾液酸修饰CuZn-SOD的工艺。聚唾液酸经活化后通过共价键连接到SOD表面的Lys上,再用TOSOH Toyopearl HW-55F凝胶过滤层析对聚唾液酸修饰的SOD进行纯化。以修饰酶交联比和酶活保留率为优化目标,通过L9(34)双指标正交优化实验,确定了PSA:SOD摩尔用量比40:1,反应温度25℃,反应pH7.4为SOD聚唾液酸化的最适反应条件。该工艺下制得的PSA-SOD的平均交联比为3.86±0.17,平均酶活保留率为77.8±1.6％。
　　 SDS-PAGE电泳分析聚唾液酸修饰前后SOD的分子量从32kDa增大为90～100kDa。用原子力显微镜观察到修饰酶分子粒径为10～15nm,约为修饰前的4倍。修饰酶表面有一层云状包覆,呈单颗粒包覆和多颗粒包覆两种显微形态,分别对应单酶修饰和多酶修饰两种修饰方式。TNBS法测得修饰酶氨基平均修饰率为24.4％,并通过蛋白残基可及性分析,推测可能被修饰的位点为Lys(9,23,73,89,151)。进一步的验证实验表明,SOD经聚唾液酸修饰后,不仅保留了较高的天然酶活性,而且在酸碱稳定性、热稳定性和抗酶解稳定性方面明显优于天然酶。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 聚唾液酸的概述

1.1.1 聚唾液酸的结构

1.1.2 聚唾液酸的理化性质

1.1.3 聚唾液酸的生产纯化方法

1.1.4 聚唾液酸用途与衍生化研究现状

1.1.5 聚唾液酸修饰优点

1.2 模型蛋白铜锌超氧化物歧化酶概述

1.2.1 超氧化物歧化酶的理化特征

1.2.2 铜锌超氧化物歧化酶的结构

1.2.3 选择铜锌超氧化物歧化酶作为模型蛋白的原因

1.3 课题来源

1.4 本论文研究的目的和内容

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 原料

2.1.2 主要试剂

2.1.3 层析材料

2.1.4 主要仪器

2.2 实验分析方法

2.2.1 聚唾液酸含量测定

2.2.2 聚唾液酸平均分子量分析

2.2.3 蛋白质含量测定

2.2.4 内毒素含量测定

2.2.5 交联比的测定

2.2.6 SOD酶活及酶活保留率的测定

2.2.7 蛋白质羰基含量测定

2.2.8 十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2.2.9 原子力显微镜(AFM)

2.2.10 蛋白氨基修饰率测定

2.2.11 修饰酶稳定性研究

第三章 结果与讨论

3.1 原料聚唾液酸纯化及聚唾液酸和CuZn-SOD性质分析

3.1.1 聚唾液酸的纯化

3.1.2 聚唾液酸的分子量分析

3.1.3 CuZn-SOD的SDS-PAGE分析

3.1.4 SOD初酶活分析

3.2 聚唾液酸修饰CuZn-SOD的制备与优化

3.2.1 聚唾液酸的活化

3.2.2 活化聚唾液酸对CuZn-SOD的修饰

3.2.3 活化聚唾液酸修饰CuZn-SOD的条件优化

3.2.4 活化聚唾液酸修饰SOD的工艺

3.3 聚唾液酸化铜锌超氧化物歧化酶修饰产物的鉴定分析

3.3.1 修饰酶的SDS-PAGE电泳分析

3.3.2 修饰酶的原子力显微镜分析

3.3.3 修饰酶游离氨基修饰率测定和修饰位点预测

3.3.4 修饰酶稳定性研究

第四章 主要结论与展望

4.1 主要结论

4.2 展望

致谢

参考文献

附录