果蝇中一个新基因ecp的功能鉴定与分析

摘要

本文从野生型黑腹果蝇胚胎cDNA文库中筛选并克隆得到ecp全长cDNA序列。生物信息学分析表明：ECP在进化过程中是十分保守的，从果蝇、斑马鱼到哺乳动物中均有其同源蛋白存在。从结构方面来看，ECP在其氨基端带有一个亮氨酸拉链结构基序，羧基端带有一个elF5C结构域。这一结构域是elF5与elF2β的结合位点，因而ECP可能与eIF2β相互作用进而参与翻译过程。 RNA原位杂交及胚胎抗体染色的结果都表明：在果蝇胚胎中，ecp无论在RNA水平上，还是在蛋白水平上都呈现广泛表达和分布，没有明显的组织特异性。Western Blot结果表明，ECP在果蝇的胚胎、幼虫、蛹及成虫中都有持续的高表达。这些结果提示ecp可能是一个管家基因。GFP标记分析及S2细胞免疫荧光结果显示，ECP主要分布在细胞质中，推测其可能通过与elF2β相互作用而参与翻译过程。 Western Blot分析发现，ECP蛋白在果蝇中存在两种迁移率不同的形式，ECP-S和ECP-F。从这两种形式在果蝇不同发育阶段所呈现的切换规律，即：胚胎、蛹和成虫都主要表达电泳迁移率较慢的形式(ECP-s)，伴随着果蝇胚胎孵化成幼虫时即开始表达迁移率较快的形式(ECP-F)，并持续到三龄幼虫开始蛹化时又逐渐被ECP-S替代，这些结果表明。ECP-F可能与幼虫的生长发育有关。 通过免疫共沉淀分析发现多种核糖体大小亚基蛋白能被抗ECP单抗所沉淀。与此同时，蔗糖密度梯度离心的结果也表明：有部分ECP能与40S、60S核糖体亚基结合。通过酵母双杂交，我们找到了两个可能与ECP相互作用的蛋白质，elF2β和RPL5。这些结果表明ECP可能是一种核糖体相关蛋白，又因其可以和翻译起始因子eIF2β相互作用，因而ECP可能在翻译起始过程中起某种作用。 S35-Methionine掺入实验表明，通过RNAi抑制S2细胞中ECP的表达后，蛋白质合成速率下降约45％。另一方面，在ecp的第一个内含子带有P因子插入突变的果蝇1(3)03022表现为短刚毛，生长发育迟缓，翅膀变小，隐性致死等典型的minute表型。这些结果进一步支持ECP可能参与蛋白质生物合成的推论。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要缩略词表

声明

第一章文献综述 ——翻译起始机制及其调控研究进展

第一节 原核生物翻译起始研究进展

第二节 真核生物翻译起始研究进展

第三节果蝇与翻译研究

展望

参考文献

第二章实验材料与方法

一、实验材料及试剂

二、实验方法

第三章结果与讨论

第一节生物信息学分析表明ecp可能参与翻译过程

第二节ECP抗体的制备

第三节 ECP在果蝇中持续广泛表达并可能参与果蝇幼虫发育调控

第四节ECP是一个细胞质蛋白

第五节ECP是一个核糖体相关蛋白

第六节ECP与eIF2β及RPL5相互作用

第七节下调ECP表达导致翻译效率降低

结论

参考文献(结果与讨论部分)

致谢

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