伏马菌素B对HL-7702细胞周期的影响及其高暴露区食管癌组织P21基因突变的研究

摘要

目的：从细胞周期调控角度探讨FB<,1>在人正常肝细胞增殖、凋亡中的作用，并从分子水平上对细胞周期调控因子及调控通路加以研究，旨在阐明：FB<,1>诱导细胞周期作用的分子机理，结合：FB<,1>高暴露地区食管癌患者相关细胞周期调控因子基因突变的检测，从而为寻找FB<,1>致癌作用更直接的证据，探讨FB<,1>在食管癌发生发展中的病因学意义及其作用机理，为食管癌一级预防措施的制定提供科学依据。 方法：以0.0μM、0.1μM、1.0μM、10.0μM、100.0μM剂量的FB<,1>处理人正常肝细胞株HL-7702细胞24h、48h、72h、96h，检测细胞增殖(MTT法)、LDH释放率(比色法)、细胞凋亡(透射电镜及流式细胞术)、细胞周期分布(流式细胞分析术)、Cyclin E及p21mRNA表达的变化(RT-PCR法)、Cyclin E及p21蛋白表达的变化(Western blot法)。 采集江苏省淮安市楚州区食管癌手术患者的癌组织和癌旁组织，采用PCR-RFLP法检测了p21<'WAF1>基因第2外显子上31密码子的基因型分布情况，并对临床病理特征及环境因素与p21 <'WAF1>基因型分布的关系进行了研究。 结果：以0.0μM、0.1μM、1.0μM、10.0μM、100.0μM：FB<,1>剂量处理人正常肝细胞HL-7702，同剂量组随处理时间的延长大体呈现出抑制率逐渐加大而后又减少，最后逐渐促进细胞生长的态势，各浓度组的最高抑制率集中于48h至72h之间；经统计学分析未发现细胞凋亡率在各处理组中有明显差异；各剂量.FB<,1>处理HL-7702细胞48h时与对照组相比发生了G0/G1期阻滞，说明具有抑制细胞增殖的作用；但各剂量组中随着处理时间的延长，G0/G1期的比例呈先升高后降低的趋势，且随着处理剂量的增加这种变化幅度增加。RT-PCR检测发现FB<,1>降低了Cyclin E mRNA的表达同时增加了P21 mRNA的表达使得细胞增殖在48h至72h发生抑制；随着处理时间延长至96h，P21 mRNA表达减少，促使细胞由生长受抑制发展为促进生长。当低剂量(0.1μM)FB<,1>处理时，Cyclin E蛋白表达的变化可能对细胞活力影响较大，而高剂量(1.0μM和10.0μM)FBl处理时，可能P21蛋白表达的变化对细胞活力影响较大。人群流行病学调查和实验室检测结果显示：p21<'WAF1>基因第2外显子31密码子Arg/Ser基因型在癌组织中的分布高于癌旁组织，差异具有统计学意义(p<0.05)。经统计分析，未发现p21<'WAF1>基因第2外显子31密码子突变与临床病理特征、吸烟、饮酒、饮茶等环境因素存在相关性，而喜食烫食和经常食用玉米及其制品者发生p21<'WAF1>基因第2外显子31密码子突变较非喜食烫食和偶尔食用玉米及其制品者多，差异具有显著性。 结论：随处理时间的延长FB<,1>通过影响人正常肝细胞HL-7702 Cyclin E和p21基因mRNA表达和蛋白表达，使G0/G1期细胞数目减少，改变了细胞周期分布，对HL-7702细胞产生先微弱抑制后促进生长的作用。FB<,1>高暴露地区食管癌患者p21 <'WAF1> Arg/Ser基因型在食管癌组织中的分布高于癌旁组织。我们的结果提示：FB<,1>可能通过影响细胞周期调控因子的表达及细胞周期的变化，在其致癌作用中发挥一定作用，为进一步研究FB<,1>的致癌机制提供参考。

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文摘

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论文说明：主要缩略词表

声明

前言

第一部分FB1对HL-7702细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

第一章FB1对HL-7702细胞生长的影响

第一节FB1对HL-7702的细胞活性检测

第二节FB1对HL-7702细胞凋亡的影响

第三节FB1对HL-7702细胞周期分布的影响

第二章FB1对细胞周期影响的可能分子调控机制

第一节FB1对cyclinE、p21基因mRNA表达的影响

第二节FB1对cyclinE、p21基因蛋白表达的影响

小结

第二部分FB1高暴露地区食管癌组织p21WAF1基因突变的调查研究

第一章p21WAF1基因第2外显子基因突变的检测

1材料与方法

2结果

3讨论

第二章p21WAF1基因第2外显子基因突变与食管癌临床病理特征、环境因素关系研究

1材料与方法

2结果

3讨论

小结

全文总结

参考文献

致谢

作者简介

综述：伏马菌素细胞毒性的研究进展