钙蛋白酶抑制剂和前胡丙素对缺血再灌注心肌肌浆网钙泵的作用及机制

摘要

目的：心肌缺血/再灌注(Ischcmia-reperfusion,I/R)损伤是指心肌血供中断一定时间后再恢复血液供应,原缺血心肌发生较血液供应恢复前更严重的损伤。细胞内钙超载是心肌缺血/再灌注损伤的主要原因之一,而肌浆网(Sarcoplasmic reticulum,SR)在维持细胞内钙稳态方面起重要作用,因此由于钙超载而激活的钙蛋白酶(Calpain)对肌浆网蛋白的降解作用可能是缺血/再灌注损伤的一种机制。本文旨在研究Calpain抑制剂(N-Acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal,ALLN)和前胡丙素(praeruptorin C,pra-c)对缺血/再灌注大鼠心肌肌浆网钙泵(sarcoplasmic reticulum ca2+-ATPase,SERCA)的影响,进一步揭示心肌缺血/再灌注损伤作用机制和前胡丙素抗损伤的保护机制。 方法： 1.建立Langendorff离体心脏灌注模型,并将99只雄性SD大鼠随机分为control组,I/R组,ALLN+control组,ALLN+I/R组,pra-c+I/R组,ALLN+pra-c+I/R组,ALLN+H-89(PKA特异性抑制荆)+I/R组,pra-c+H-89+I/R组,ALLN+pra-c+H-89+I/R组,二甲亚砜(Dimethyl stlfoxide,DMSO)+I/R组和聚乙二醇400(polyethylene glycol 400,PEG400)+I/R组。 2.分别检测再灌注15分钟时冠脉流量(coronary flow,CF)和冠脉流出液中LDH漏出量。 3.实验结束后,每组随机取3枚心脏,胶原酶I分离心肌细胞,后分别予FLUO-3/AM和Annexin-V/PI荧光染色剂负载细胞,利用流式细胞仪检测细胞内钙荧光强度和细胞凋亡率,并计算凋亡指数。 4.再灌注结束后,低温超速离心制备心肌肌浆网。 5.荧光分光光度计测定AMC(7-Amino-4-methylcoumarin)荧光强度来反映Calpain活性。 6.免疫印迹法检测心肌细胞Calpain和肌浆网钙泵蛋白表达量。 7.分别采用改良p-NPP法和Millipore过滤技术测定肌浆网钙泵的活性和ATP依赖的SR45Ca2+摄取率。 结果：同control组相比,I/R组CF、肌浆网钙泵蛋白表达量、肌浆网钙泵的活性和45SCa2+摄取率显著降低(P<0.05),LDH、Calpain活性和蛋白表达量、胞内钙荧光强度和细胞凋亡指数均显著升高(P<0.05)。同I/R组相比,若在缺血前预先使用10μmol/L ALLN、100μmol/L前胡丙素或同时使用10μmol/L ALLN和100μmol/L前胡丙素,则CF、肌浆网钙泵蛋白表达量、肌浆网钙泵的活性和45Ca2+摄取率显著增高(P<0.05),LDH、Calpain活性和蛋白表达量、胞内钙荧光强度和细胞凋亡指数均显著降低(P<0.05),且三组之间各项指标均无统计学差异,但这些作用(除Calpain蛋白表达量外)均可被10μmol/L PKA抑制剂H-89所阻断。 结论： 1.Calpain抑制剂(ALLN)和前胡丙素对离体心脏缺血/再灌注损伤具有相似的保护作用,可以减轻缺血/再灌注损伤所致的细胞内钙超载和细胞凋亡,其作用与抑制Calpain活性和Calpain蛋白表达量有关。 2.Calpain抑制剂(ALLN)和前胡丙素均可一定程度恢复缺血/再灌注损伤对心肌肌浆网钙泵功能和蛋白表达量的影响,且两者保护程度相似,可能与两者抑制Calpain对肌浆网钙泵的降解有关。 3.上述保护作用可以被蛋白激酶A抑制剂(H-89)所阻断,提示蛋白激酶A通过影响Calpain活性(不影响Calpain蛋白表达量),参与了Calpain抑制剂(ALLN)和前胡丙素对缺血/再灌注损伤的保护作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表（Abbreviation）

声明

前言

第一章文献综述：钙蛋白酶对心肌缺血/再灌注损伤的影响

第二章实验材料和方法

第三章实验结果

第四章讨论

结论

致谢

参考文献

作者简介及在校期间发表文章