粘细菌外膜蛋白发育相关基因的筛选及功能研究

摘要

目的：粘细菌属于最简单的具有多细胞发育结构的生物体之一，其发育过程与真核生物存在相似性。粘细菌属原核生物，生活周期具社会性行为，是研究多细胞结构形态发生机制的良好模型。作为细胞与外界环境问的界面，细胞膜几乎与发育中各种生物活动密切相关，然而迄今为止所克隆的与粘细菌发育相关的膜蛋白基因数量非常有限，一些重要的应定位于细胞膜的蛋白因子一直未能找到。本论文拟找出在粘细菌发育阶段表达量上调的膜蛋白基因，并对这些新蛋白因子进行基因敲除实验，以明确其生物学功能。 方法：本实验最初使用双向电泳技术对粘细菌发育与非发育阶段细胞膜蛋白的表达进行了研究。随后利用六种外膜蛋白预测软件对粘细菌基因组读码框编码产物进行结构预测，将六种软件均预测为外膜蛋白的基因筛选出来，分别构建转录融合载体，即将其上游的调控区域与报告基因lacZ相连，经电穿孔分别导入粘细菌野生株DK1622，通过测定重组菌株β-半乳糖苷酶活性寻找出粘细菌发育阶段表达的基因。对筛选到的基因进行基因敲除，观察该敲除菌株的表型变化以初步明确其生物学功能。 结果：1.在双向电泳实验中，比较几次实验所得到粘细菌在营养性生长和发育12h的2-D图谱，发现每次实验均存在一些发育阶段蛋白量明显增加的点，但是不同次实验的重复性较差，我们从中挑选了5个在两次以上实验中蛋白量均有明显增加的斑点进行了质谱分析，但质谱分析结果均没有得到粘细菌膜蛋白。2.利用生物信息学软件分析，在粘细菌基因组中筛选出了12个编码外膜蛋白的基因。报告基因检测结果提示其中2个基因(Mx3106，Mx3883)在发育起始阶段表达量上升，通过氨基酸序列比较，基因Mx3106所编码的蛋白与粘细菌中对IV型菌毛的形成以及S运动至关重要的PilQ同源。Mx3883与革兰氏阴性菌分子伴侣/引领蛋白通路中的引领蛋白同源，其所在操纵子与粘细菌孢子外壳蛋白的分泌有关。其余十个基因均与物质跨膜运输有关，在发育阶段表达量均下降或未表达。其中Mx1316，Mx4559，Mx6044，Mx6579，Mx6911为TonB依赖的外膜蛋白受体，主要在大分子跨膜物质运输中起重要作用。3.通过同源重组获得Mx3106和Mx3883基因敲除菌株。这两种敲除菌株在营养丰富的固体平板表面运动无异常，在饥饿平板能正常聚集发育为子实体，在现有实验条件下对孢子的形成也无影响。 结论：1.利用生物信息软件分析粘细菌基因组读码框，预测出12个可能编码外膜蛋白的基因。基因Mx3106和Mx3883在发育时期表达上调，其余10个基因在发育时期几乎不表达或表达下降，这10个基因均与物质跨膜转运有关。2.Mx3106与和IV型菌毛组装有关的PilQ同源，单独敲除Mx3106不影响粘细菌S运动及发育阶段的细胞聚集。3.生物信息学分析提示Mx3883作为革兰氏阴性菌分子伴侣/引领蛋白通路成员参与发育后期一种孢子外壳蛋白的分泌，虽然本论文实验条件下敲除Mx3883对孢子数目没有明显影响，但仍不能排除Mx3883参与发育后期孢子的分化成熟。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

文献综述 粘细菌运动机制的研究

第一章材料与方法

第二章实验结果

第三章讨论

第四章小结

参考文献

致谢

作者简介