5-溴汉防己甲素与汉防己甲素逆转K562/A02细胞多药耐药性的比较研究

摘要

目的：5-溴汉防己甲素是中草药提取的双苄基异喹啉生物碱-粉防己碱(汉防己甲素)的溴化产物,具有逆转P-糖蛋白介导的肿瘤多药耐药(MDR)作用。本课题旨在研究比较BrTet与传统中药Tet对人慢性粒细胞白血病急性红白血病变细胞株K562/A02多药耐药的逆转作用,并测定编码P糖蛋白(P-gp)的多药耐药基因(MDR1)mRNA的表达水平,以探讨它们逆转MDR的作用机理,为BrTet作为耐药逆转剂的临床应用提供理论依据。 方法：(1)采用甲基四唑蓝法(MTT)法检测阿霉素(adfiamycin,ADM),BrTet,Tet单独作用于K562/A02细胞和K562细胞时对细胞的增殖影响,分别计算出其半数抑制量(50％ Inhibiting Concentration,IC50)。(2)采用MTT法检测ADM联合应用BrTet、Tet时,对K562/A02细胞和K562细胞增殖影响的变化,并计算IC50及逆转倍数(Fold Reversal,FR)。(3)采用流式细胞仪(Flow Cytometry,FCM)检测K562细胞、K562/A02细胞凋亡率以及细胞内ADM浓度。(4)采用流式细胞仪和Western blot法检测K562细胞、K562/A02细胞P-gp的表达。(5)采用半定量PCR(RT-PCR)测定细胞MDR1基因mRNA表达水平；(6)建立裸小鼠皮下移植瘤模型,比较BrTet、Tet在体内的耐药逆转作用。 结果：(1)ADM联合BrTet,Tet对K562细胞和K562/A02细胞的毒性作用：①K562/A02、K562细胞对ADM的IC50值分别为(57.43±4.55)mg/L和(1.164±0.05)mg/L,K562/A02对ADM的耐药倍数为49.51倍；②1.5 μmol/L及更低浓度的BrTet或Tet对K562细胞和K562/A02细胞均无明显细胞毒作用,其抑制率均小于10％；③加入1.0 μmol/L的Tet后,K562/A02细胞对ADM的耐药倍数为12.17倍。加入0.25μmol/L、0.5 μmol/L和1.0 μmol/L的BrTet后,K562/A02细胞对ADM的耐药倍数分别为17.88、9.9和4.24倍。(2)K562/A02细胞48小时凋亡率为(2.20±0.04)％；ADM单独作用于K562/A02细胞48小时凋亡率为(2.69±0.05)％,0.25μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L的BrTet以及1.0 μmol/L的Tet联合ADM作用于K562/A02细胞48小时后,凋亡率分别为(22.63±0.87)％,(29.40±0.70)％,(61.43±0.85)％和(19.10±1.20)％。(3)流式测定细胞内ADM药物浓度(与凋亡干预条件相同)①10mg/L ADM作用于K562/A02细胞2小时后细胞内ADM平均荧光强度为82;②K562/A02经Tet(1.0/μmol/L)或BrTet(1.0μmol/L)干预48小时细胞内ADM平均荧光强度分别为313和418,与单用ADM组相比分别提高了51.6％和69.O％的ADM浓度。(4)流式测定K562/A02细胞膜P-gp的阳性率为97.97％。BrTet(1.0μmol/L)及Tet(1.0μmol/L)作用于K562/A02细胞48小时后P-gp的阳性率分别为：54.86％,81.18％。(5)Western blot法检测对照组K562/A02细胞P-gp条带与β-action的灰度比值为0.815±0.034。经BrTet(1.0μmol/L)及Tet(1.0μmol/L)作用48小时后,相应的P-gp条带与β-action的灰度比值分别为0.340±0.017和0.417±0.023,P-gP蛋白表达下调分别为51.11％和41.73％。(6)RT-PCR检测细胞MDRlmRNA的表达：①K562细胞MDRImRNA表达为阴性,K562/A02细胞MDRl mRNA表达为阳性；②K562/A02细胞的空白对照组,1.0μMBrTet组,0.5μM BrTet组,0.25μM BrTet组,1.0μM Tet组MDRl/β-action分别为0.985±0.104,0.321±0.047,0.542±0.164,0.696±0.237,0.498±0.168。(7)单独应用ADM对于K562/A02裸小鼠皮下移植瘤的抑制率为3.51％,腹腔给药10 mg/kg BrTet以及Tet后,对于抑制率的抑制率分别为51.26％和10.55％。 结论：(1)BeTet可下调耐药细胞表面P-gP的表达、促进ADM进入细胞内,提高细胞内ADM浓度以杀死K562/A02细胞。(2)BeTet可明显下调MDRl基因的表达,能明显逆转K562/A02的耐药性。(3)BeTet可明显抑制K562/A02裸小鼠皮下移植瘤的增殖,且其逆转作用强于相同浓度的Tet,差异具有统计学意义。

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论文说明：缩略词

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前 言

文献综述：肿瘤细胞多药耐药机制及逆转的研究进展

第一部分材料与方法

第二部分实验结果

第三部分讨论

全文小结

参考文献

作者简介