基于电纺纳米纤维的仿骨组织工程支架材料的研究

摘要

在近二十年里骨组织工程支架材料由于在骨修复治疗应用的巨大潜力而成为全世界的一个热点研究领域。为此人们开发了多种骨组织工程支架材料的制备方法。但是如何解决骨组织工程支架材料要求的高孔隙率与高机械强度之间的矛盾仍然是一个棘手的问题。而在自然界，天然骨具有很高的孔隙率和力学强度，这是由于天然骨单元是由羟基磷灰石纳米杆与胶原蛋白纳米纤维复合组成的取向排列纤维构成。因此本论文的目的是通过将羟基磷灰石纳米杆引入取向电纺纳米纤维薄膜中模仿天然骨的结构从而制备出具有良好生物相容性和生物力学性能的骨组织工程支架材料。
　　 本论文在本研究小组前期工作基础上，对液相-固相-溶液相制备纳米粒子方法进行改进，通过胶体金参考体系制备了不同尺寸的和分散性改进的羟基磷灰石纳米杆。通过所制备样品红外表征结果与标准羟基磷灰石红外图谱对比，证实了制备材料为羟基磷灰石。透射电镜表征结果表明反应温度为90℃时，制备的羟基磷灰石纳米杆的长度(L)为111±24nm，直径(D)为10±2.7nm；反应温度为120℃时，制备的羟基磷灰石纳米杆的长度(L)为212±32nm，直径(D)为12±2.9nm；反应温度为180℃时，制备的羟基磷灰石纳米杆的长度(L)为189±30nm，直径(D)为18±3.8nm。
　　 本论文利用静电纺丝技术分别制备了无取向的和取向的纳米纤维薄膜，扫描电镜表征分析表明制备的纳米纤维比较均匀。偏振红外结果表明聚乳酸分子链和羟基磷灰石优先沿平行纳米纤维轴方向排列，透射电镜表征表明大部分羟基磷灰石纳米杆分布在纳米纤维内部并且优先沿纳米纤维轴方向排列，羟基磷灰石纳米杆在纳米纤维中存在明显的团聚，且随着羟基磷灰石纳米杆含量的增加，团聚进一步加重。
　　 本论文对所制备的电纺薄膜进行拉伸实验测试结果表明取向电纺薄膜沿平行纳米纤维轴方向的拉伸强度(57.36±5.23MPa)高于无取向电纺薄膜拉伸强度(43.05±2.56MPa)；纳米纤维的平均直径对所制备的复合纳米纤维薄膜的拉伸强度影响较小，而纳米纤维中羟基磷灰石纳米杆的尺寸对制备的复合纳米纤维薄膜的拉伸强度有显著影响：通过将在反应温度分别为90℃(L：111±24nm，D：10±2.7nm)，120℃(L：212±32nm，D：12±2.9nm)，180℃(L:189±30nm，D：18±3.8nm)下制备的不同尺寸的羟基磷灰石纳米杆引入纳米纤维中制备的复合纳米纤维薄膜的拉伸实验结果发现：复合纳米纤维薄膜的拉伸强度分别为66.14±5.3MPa，75±2.59MPa和53.31±2.76MPa；复合纳米纤维薄膜的拉伸模量分别为96.91±4.34MPa，266.26±21MPa和131.41±14.76MPa。这说明细长的纳米杆更能增强复合纳米纤维薄膜的拉伸强度和拉伸模量，这可能是由于细长纳米杆与聚乳酸高分子间作用力更强的原因。另外可以发现纳米纤维中羟基磷灰石纳米杆含量对复合纳米纤维薄膜拉伸强度的影响也很明显：不含羟基磷灰石纳米杆的复合纳米纤维薄膜的拉伸强度是57.36±5.23Mpa，含10wt％羟基磷灰石纳米杆的复合纳米纤维薄膜的拉伸强度是72.32±6.72MPa，含20wt％羟基磷灰石纳米杆的复合纳米纤维薄膜的拉伸强度是75±2.59MPa，含40wt％羟基磷灰石纳米杆的复合纳米纤维薄膜的拉伸强度是53.38±0.98MPa。根据红外光谱和透射电镜表征结果进一步解释这个现象，大部分羟基磷灰石纳米杆位于纳米纤维的内部并且沿纳米纤维轴方向排列，这种结构和骨结构类似，从而羟基磷灰石纳米杆与聚乳酸分子能够形成较强的相互作用，因此可以有效提高复合纳米纤维薄膜的机械强度。当羟基磷灰石纳米杆的浓度增大但还没有出现过度的团聚时，复合纳米纤维薄膜的拉伸强度继续提高。而当复合纳米纤维薄膜中羟基磷灰石纳米杆的含量增至40wt％时羟基磷灰石纳米杆团聚过于严重将降低其与高分子间的作用力从而降低整个复合材料的机械强度。而且羟基磷灰石纳米杆的分布不均也使得纳米纤维中局部缺少高分子材料和/或缺少HA纳米杆从而限制了复合纳米纤维薄膜整体机械强度的提高，此外，由于HA纳米杆团聚及分布不均还会导致纳米纤维的严重变形即部分纳米纤维片段细化并因此影响复合纳米纤维薄膜的整体机械强度。这些会在高含量HA纳米杆的复合纳米纤维薄膜中显现其效果。而且由于在所有复合纳米纤维薄膜中HA纳米杆分布不均并且团聚都较为明显，因此HA纳米杆的增强作用还不是十分突出。这表明通过降低团聚及提高分布均匀性人们还将能够进一步有效提高复合纳米纤维薄膜的整体机械强度。
　　 本论文对制备的电纺薄膜进行了蛋白质吸附实验和细胞培养实验从而研本论文对制备的电纺薄膜进行了蛋白质吸附实验和细胞培养实验从而研究电纺薄膜的生物相容性。通过紫外法，红外法对所制备的电纺薄膜进行蛋白吸附实验，结果表明当电纺薄膜的纤维直径从700-1000nm降低为400-600nm和300-500nm时，电纺薄膜对于免疫球蛋白(IgG)，白蛋白(Alb)，纤维蛋白(Fib)这三种蛋白的吸附量均增大。蛋白吸附实验结果与电纺薄膜的接触角实验结果相符合：随着纤维直径的降低，电纺薄膜的接触角增大。对于纤维直径更小的薄膜，表面能的影响和更高的比表面积增大了蛋白的吸附。另外发现Alb与Fib的比值RA/F和Alb与IgG的比值RA/I(用于评价材料的凝血性能)随纤维直径的降低而增大。而RA/F和RA/I的增大会改善材料的血液相容性，因此我们可以通过简单的调节纳米纤维的直径从而制备出具有不同凝血性能的材料，这对生物材料的研制具有指导意义。电纺薄膜与小鼠骨髓间充质干细胞共培养研究表明，细胞可以在电纺薄膜表面粘附生长，而且取向纤维可以诱导细胞取向生长；MTT实验结果表明随着纤维直径从567±208nm增大到860±200nm和1150±310nm，电纺薄膜的细胞增殖率从71.9％下降到70.6％和55.2％，说明随着电纺薄膜的纤维直径的降低，电纺薄膜黏附的细胞变多。这个结论与蛋白吸附量、RA/F与RA/I的变化趋势一致，说明蛋白吸附对细胞的黏附具有很重要的意义，而其具体机理有待进一步研究。我们初步认为这种复合材料有望作为骨组织工程支架材料。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1课题的研究意义

1.2课题的研究背景

1.2.1骨组织工程的发展状况

1.2.2骨组织工程支架材料的发展历史和研究现状

1.2.3羟基磷灰石在骨组织工程支架材料中的应用

1.2.4聚乳酸在骨组织工程支架材料中的应用

1.2.5骨组织工程支架材料的制备方法

1.2.6静电纺丝技术在骨组织工程支架材料中的应用

1.2.7天然骨的结构

1.3本论文的主要内容

参考文献

第二章液相-固相-溶液相法制备纳米粒子的改进及其在羟基磷灰石纳米杆中的应用

2.1胶体金的制备和表征

2.1.1胶体金制备和表征的实验材料与仪器

2.1.2胶体金制备和表征的实验内容和方法

2.1.3胶体金制备的实验结果与讨论

2.2羟基磷灰石纳米杆的制备和表征

2.2.1羟基磷灰石纳米杆制备和表征的实验材料与仪器

2.2.2羟基磷灰石纳米杆制备和表征的实验内容和方法

2.2.3羟基磷灰石纳米杆制备的实验结果与讨论

2.3本章小结

参考文献

第三章电纺纳米纤维薄膜的制备及表征

3.1聚乳酸电纺纳米纤维薄膜的制备及表征

3.1.1聚乳酸电纺纳米纤维薄膜制备及表征的实验材料和仪器

3.1.2聚乳酸电纺纳米纤维薄膜的制备及表征的实验内容和方法

3.1.3聚乳酸电纺纳米纤维薄膜制备的实验结果和讨论

3.2含羟基磷灰石纳米杆的电纺复合纳米纤维薄膜的制备及表征

3.2.1复合纳米纤维薄膜制备及表征的实验材料和仪器

3.2.2复合纳米纤维的制备及表征的实验内容和方法

3.2.3复合纳米纤维薄膜制备的实验结果与讨论

3.3本章小结

参考文献

第四章电纺纳米纤维薄膜的生物力学测试

4.1电纺纳米纤维薄膜生物力学实验材料与仪器

4.2电纺纳米纤维薄膜生物力学实验内容和方法

4.3电纺纳米纤维薄膜生物力学实验结果与讨论

4.3.1无取向PLLA电纺薄膜的拉伸实验结果

4.3.2取向PLLA电纺薄膜的拉伸实验结果

4.3.3含HA纳米杆(A)PLLA取向电纺复合纳米纤维薄膜的拉伸实验结果

4.3.4含HA纳米杆(B)PLLA取向电纺复合纳米纤维薄膜的拉伸实验结果

4.3.5含HA纳米杆(C)PLLA取向电纺复合纳米纤维薄膜的拉伸实验结果

4.3.6电纺薄膜的拉伸实验结果讨论

4.4本章小结

参考文献

第五章电纺纳米纤维薄膜的生物学测试

5.1电纺纳米纤维薄膜的蛋白质吸附实验

5.1.1实验材料

5.1.2实验仪器

5.1.3实验内容和方法

5.1.4考马斯亮蓝染色法实验结果

5.1.5红外光谱法实验结果

5.1.6 RA/F和RA/I结果

5.1.7讨论

5.2电纺纳米纤维薄膜的细胞培养实验

5.2.1实验材料和仪器

5.2.2实验内容和方法

5.2.3细胞形态观察

5.2.4 MTT实验结果

5.3本章小结

参考文献

第六章总结与展望

6.1全文总结

6.2展望

硕士在读期间发表的论文

致谢