果蝇神经粘附分子Neuroligin及其相关蛋白在突触发育中的功能研究

摘要

神经细胞的分化、发育与细胞间非对称联结密切相关，其中跨膜蛋白在细胞间的信息传递方面起着十分重要的作用。Neurexin和Neuroligin是一对异源性相互作用的神经粘附分子，它们在跨突触前、后膜的桥接中起着重要的作用。体外研究发现，Neurexin或Neuroligin可以诱导突触前和突触后的分化，但是其机制还不清楚。本研究工作以果蝇为模式动物，解析果蝇Neuroligin的在体(invivo)功能，探讨Neuroligin和Neurexin在突触发育以及在突触可塑性中所起的作用。
　　 果蝇基因组中存在脊椎动物neuroliginl基因的一个高度同源的基因(CG13772)，CDS全长为3747bp，共编码1248个氨基酸，命名为dneuroligin(dnl)。果蝇Neuroligin(DNL)也是一个单跨膜的分子，其胞外有一个大的乙酰胆碱脂酶的类似结构域，其后是跨膜区和短的胞内尾巴，胞内末端含有一个保守的PDZ结合基序。原位杂交结果表明dnl在果蝇胚胎发育后期集中表达在中枢神经系统。免疫荧光染色证明DNL在胚胎、幼虫及成虫都集中表达在中枢神经系统的脑及腹神经管的突触密集区，并和一些突触标记分子存在共定位。DNL在外周神经系统主要分布于typeⅠ类型的bouton，与Dlg、Fasll和DNRX均部分共定位，呈不均匀斑点状分布，并初步显示DNL在突触前和突触后均有分布。
　　 我们利用Ends-out技术制备了dnl基因的突变体，进一步对突变体中的bouton的数量以及突触的结构进行了分析，结果显示：在dnl突变体中bouton的数量与野生型相比减少了40％，并且这种减少均能被Elav-Gal4和24B-gal4驱动的全长DNL的表达所挽救。这表明DNL可能参与了突触的形成。
　　 与野生型相比，dnl变体的NMJ中，DGluRIIA的募集量增加，DGluRIIB和DGluRⅢ的募集量减少；突触前活跃区的标记物Brp的spots的数量增多，突触后PSD的标记物D-PAK的cluster的面积明显变小，表明DNL是突触分化和突触成熟所必需的。
　　 超微结构分析表明：dnl突变体的神经肌肉接头呈现T-bar的数量增加，SSR的厚度变薄，说明DNL参与了突触的分化。
　　 利用经典的嗅觉联想式学习记忆测试系统分析突变体发现：当dnl突变后，其学习指数与野生型相比下降50%，表明DNL参与了高级神经活动，与DNRX突变表型相似。
　　 我们先前的研究发现果蝇DNRX在突触的发育过程中起着重要的作用。本文的进一步研究显示dnrx和caki在幼虫的运动能力、囊泡的再循环以及突触的功能方面存在着遗传学上的相互作用。尽管两者在生化水平上相互作用通过DNRX的PDZ结合结构域，但是两者定位于突触区域是相互独立的。
　　 本研究还显示，DNL可与DNRX在生物化学水平上相互作用；dnl和dnrx双突变时，突触表现出更加严重的结构和功能缺陷，并在二龄幼虫时期致死。这说明果蝇Neuroligin-Neurexin参与调控突触的发育和功能。