磁性纳米四氧化三铁颗粒联合5-溴汉防已甲素在逆转白血病多药耐药中的作用及机理研究

摘要

目的：
　　 多药耐药（Multidrug resistance，MDR）恶性血液病化疗失败和复发的主要原因，逆转MDR对白血病的治疗有重要意义。本研究旨在探讨磁性纳米四氧化三铁颗粒（magneticnanoparticle of Fe3O4，Fe3O4-MNPs）和5-溴汉防己甲素（5-bromotetrandrine，BrTet）单独及联合应用在体内、外协同化疗药物逆转白血病细胞株K562/AO2细胞多药耐药的疗效，研究其逆转多药耐药的作用机理，为临床应用提供理论依据。
　　 方法：
　　 1.采用甲基四唑蓝法（MTT）法检测Fe3O4-MNPs、BrTet单独或联合应用协同化疗药物柔红霉素（daunorubicin，DNR）对K562/AO2细胞和K562细胞增殖影响的变化，并计算IC50及逆转倍数（fold reversal，FR）；
　　 2.采用光镜观察细胞形态，琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡“DNA ladder”；采用流式细胞仪（flow cytometry FCM）检测K562细胞、K562/AO2细胞凋亡率以及细胞内DNR浓度；采用FCM检测正常人外周血造血干细胞在药物作用后细胞内DNR浓度；
　　 3.建立裸小鼠皮下移植瘤模型，比较Fe3O4-MNPs、BrTet在体内的耐药逆转作用，观察药物对裸小鼠重要脏器的影响；
　　 4.采用Western blot法检测药物作用后K562/AO2细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、wt p53、Fas、Caspase-3和耐药相关基因Mdr1、Mrp1、Mrp2、Mrp4、Mrp5的蛋白表达；
　　 5.采用Real time RT-PCR方法检测药物作用后K562/AO2细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、wt p53、Fas、Caspase-3和耐药相关基因Mdr1、Mrp1、Mrp2、Mrp4、Mrp5的mRNA表达水平。
　　 结果：
　　 1.K562和K562/AO2细胞的IC50分别为0.56±0.04mg/L和18.18±0.02mg/L，加用Fe3O4-MNPs和BrTet（单独或联合）处理后DNR对K562细胞的IC50均无明显变化；加用Fe3O4-MNPs和BrTet处理后DNR对K562/AO2细胞的IC50分别为4.23±0.05mg/L、2.424±0.03mg/L，两药联合作用后DNR对K562细胞的IC50值为1.024±0.08mg/L，逆转剂处理前后DNR对K562/AO2细胞的IC50有显著差异。
　　 2.单用DNR时K562细胞内DNR平均荧光强度为105.10±15.41，加用Fe3O4-MNPs和BrTet（单独或联合）处理后细胞内DNR平均荧光强度较单用DNR组细胞无明显提高；K562/AO2细胞内DNR平均荧光强度为29.53±3.65，Fe3O4-MNPs以及BrTet联合DNR分别作用于K562/AO2细胞48小时后，细胞内DNR平均荧光强度较单用DNR组细胞明显提高，两药联合作用后细胞内DNR平均荧光强度较单用DNR组、Fe3O4-MNPs逆转组、BrTet逆转组均明显提高；单用DNR时PBHSC细胞内DNR平均荧光强度为302.71±14.12，说明DNR对PBSCT细胞的毒性比K562/AO2细胞大；加用Fe3O4-MNPs和BrTet（单独或联合）处理后较单用DNR组均无明显提高。
　　 3.K562细胞以及K562/AO2细胞成瘤率均为100％；对于K562移植瘤，各组之间肿瘤抑制率差异无显著性；对于K562/AO2移植瘤，Fe3O4-MNPs协同DNR、BrTet协同DNR及Fe3O4-MNPs联合BrTet协同DNR组均可明显抑制移植瘤的增殖，肿瘤抑制率分别为28.17±0.98％、43.88±0.47％、62.274±0.48％，而单用DNR组的肿瘤抑制率仅为3.67±0.08％，差异有显著性；同时肿瘤组织病理观察显示联合逆转组肿瘤细胞死亡明显，各实验组心、肾、脾等脏器无明显病理改变。
　　 4.当不同药物分别依次作用于K562细胞48小时后，空白对照组、单用Fe3O4-MNPs、BrTet时K562细胞凋亡率分别为4.33±0.45％、4.60±0.62％、4.274±0.81％，单用DNR时K562细胞凋亡率为51.534±0.71％，加用Fe3O4-MNPs和BrTet（单独或联合）处理后K562细胞凋亡率与单用DNR组相比差异无统计学意义；当不同药物分别依次作用于K562/AO2细胞48小时后，空白对照组、单用Fe3O4-MNPs、BrTet时细胞凋亡率分别为2.454±0.35％、2.724±0.42％、2.684±0.67％，单用DNR时细胞凋亡率为6.744±0.38％，与单用DNR相比，Fe3O4-MNPs、BrTet联合DNR组K562/AO2细胞凋亡率明显增加，分别为13.14±0.29％、57.24±1.16％，差异具有统计学意义，DNR、Fe3O4-MNPs、BrTet三者联合时K562/AO2细胞凋亡率最高，较DNR单用及联合Fe3O4-MNPs、BrTet组均明显增加达67.83±1.37％，差异具有统计学意义。
　　 5.和K562细胞相比，K562/AO2细胞的Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平较高，Bax，wtp53及Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平较低，Fas的mRNA表达水平较低，蛋白量无明显差异；Fe3O4-MNPs可下调K562/AO2细胞的Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平，上调Bax及Fas mRNA和蛋白的表达，对wtp53和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平无明显影响；BrTet能上调K562/AO2细胞的Fas mRNA和蛋白水平，对Bcl-2，Bax，wt p53及Caspase-3的转录和蛋白无明显影响；
　　 6.K562/AO2细胞的Mdr1，Mrp1，Mrp2，Mrp4和Mrp5的mRNA水平明显较K562细胞高，而Mrp3mRNA表达水平低于K562细胞，两者的Bcrp和Lrp表达水平无明显差别。Fe3O4-MNPs对K562/AO2细胞的Mdr1、Mrp1、Mrp2、Mrp4、Mrp5 mRNA和蛋白水平均有下调作用，与DNR联合应用后下调作用更加明显，BrTet单用对Mdr1、Mrp1、Mrp2、Mrp4、Mrp5 mRNA和蛋白水平也有明显的下调作用，与DNR联合应用后，以上几种基因的mRNA表达下调更加显著，但蛋白水平仅Mdr1、Mrp1表达下调，Mrp2、Mrp4、Mrp5明显下调。
　　 结论：
　　 1.10ug/mL Fe3O4-MNPs对白血病细胞株K562细胞无增敏作用，在体外、体内均可逆转耐药株K562/AO2对DNR的耐药，不增加造血干细胞内的化疗药物浓度说明其对肿瘤细胞具有一定的靶向性，对正常细胞的影响小，安全性较好，体内实验也未增加化疗药物的损害。
　　 2.0.35μg/ml BrTet对白血病敏感细胞株K562无增敏作用，在体外、体内均观察到可明显逆转白血病耐药细胞株K562/AO2对化疗药物的耐药性，不增加造血干细胞内的化疗药物浓度，体内实验也未增加对重要脏器的损害，具有良好的安全性。
　　 3.Fe3O4-MNPs与BrTet两者联合逆转K562/AO2对DNR的耐药，在体外和体内均显示出明显的协同作用。且此浓度下两种药物单独及联合应用均不增加化疗药物对造血干细胞的杀伤及细胞内的化疗药物浓度，联合应用在增加疗效的同时并未增加毒副作用，有较好的安全性。
　　 4.BrTet逆转白血病耐药细胞株K562/AO2细胞耐药的作用机制可能主要为从基因和蛋白水平抑制了多药耐药相关基因Mdr1、Mrp1、Mrp2、Mrp4、Mrp5的表达，其中Mdr1、Mrp1是主要的作用位点；BrTet并非通过诱导细胞凋亡来克服耐药，但可通过增加细胞内化疗药物浓度从而增强了化疗药物的诱导细胞凋亡作用，在对凋亡相关基因的影响方面，仅对Fas转录与表达水平有轻度的上调作用，对Bcl-2，Bax，wt p53和Caspase-3基因的转录与表达均无明显影响。
　　 5.Fe3O4-MNPs从基因和蛋白水平对多种耐药相关基因Mdr1、Mrp1、Mrp2、Mrp4、Mrp5均有下调作用，在与化疗药物联合应用后此作用更强。Fe3O4-MNPs本身无诱导白血病细胞凋亡的作用，但可增强化疗药物的诱导细胞凋亡作用，可下调Bcl-2，上调Bax mRNA和蛋白水平，上调Fas mRNA和蛋白水平，但作用均较弱，在与化疗药物联合应用后此作用明显增强，对wt p53和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平无明显的影响，但在联合化疗药物后明显上调。说明Fe3O4-MNPs克服肿瘤耐药的机制可能与其对多种基因的表达影响有一定的关系，这种影响也许不具有特异性，在单用时作用较弱，但联合化疗药物后这一作用明显增强。

目录

文摘

英文文摘

缩略词

前言

综述

参考文献

第一部分 联合应用磁性纳米四氧化三铁颗粒和5-溴汉防己甲素逆转白血病细胞株K562/A02耐药疗效的研究

第一章 材料与方法

第二章 实验结果

第三章 讨论

第二部分 磁性纳米四氧化三铁颗粒和5-溴汉防己甲素逆转K562/A02细胞多要耐药机制的研究

第一章 材料与方法

第二章 实验结果

第三章 讨论

参考文献

总结与展望

附录:作者发表论文清单

致谢