单抗偶联靶向超抗原SEA的制备及其体内外抗膀胱癌实验研究

摘要

膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,其中70％～80%是以复发和进展为特征的非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC),标准的治疗方案是经尿道切除辅以膀胱灌注化疗或免疫治疗(如卡介苗BCG等)。然而当前的膀胱灌注药物不是疗效有限,就是会引起严重的毒副作用;因此迫切需要一种新的膀胱灌注药物。
　　 与BCG类似,超抗原SEA也是一种强大的T细胞激活剂,可对包括膀胱肿瘤在内的多种肿瘤细胞产生强大的MHCⅡ分子依赖的杀伤作用。但是由于仅有很少一部分膀胱肿瘤细胞表达MHCⅡ分子,临床单一应用超抗原SEA灌注治疗膀胱癌难以获得满意的疗效。
　　 鉴于有研究显示单抗靶向的超抗原不受上述限制,我们认为灌注单抗靶向的超抗原SEA可能是一种更强大也更安全的治疗SBC策略。因此本实验的目的旨在制备单抗靶向的超抗原SEA并在体内外考察其抗膀胱肿瘤活性。
　　 1.单抗偶联靶向超抗原SEA的制备及鉴定
　　 以木瓜蛋白酶、BDI-1抗体比率1:100制备的Fab段与SEA以5倍抗体过量用SPDP偶联;经surperdex-200柱纯化:偶联蛋白、Fab、SEA洗脱出峰时间分别为16、27.5、30 min;SDS-PAGE电泳显示在250 kd出现连续条带;免疫组化、免疫荧光显示仅偶联蛋白组膀胱癌细胞膜呈阳性染色;CCK-8、ELISA法显示偶联蛋白促PBMC增殖指数PI、PBMC上清IL-2、TNF-α、IFN-γ浓度与SEA组差异均无统计学意义(P≥0.05)。提示成功制备单抗偶联靶向超抗原SEA;并使其保持了良好的T细胞刺激活性和靶向活性。
　　 2.单抗偶联靶向超抗原SEA对人膀胱癌细胞株BIU-87的抑制作用及机制研究
　　 试验分对照组、SEA组及单抗靶向SEA实验组,CCK-8法显示单抗靶向SEA组细胞增殖抑制率显著高于对照组及SEA组;荧光染色法、流式细胞术检测显示单抗靶向SEA组凋亡率显著高于SEA组及对照组(P＜0.05);实验组较对照组均有上调Caspase3/7酶活性及Bax/Bcl-2比值作用,其中单抗靶向SEA组显著高于SEA组(P＜0.05)。而共培养上清中的IL-2、TNF-α、IFN-γ浓度单抗靶向SEA组与SEA组差异无统计学意义(P＞0.05)。提示单抗靶向SEA较SEA对膀胱肿瘤细胞显示出更强大的增殖抑制作用,这可能与其进一步上调肿瘤细胞Bax/Bcl-2比值、增强Caspase3/7酶活性促进其凋亡有关。
　　 3.人免疫重建荷人膀胱癌SCID小鼠复合模型的建立
　　 将预处理的SCID小鼠分空白分对照组、单纯免疫重建组、单纯荷瘤组及复合模型组,分别经腹腔注射人淋巴细胞和(或)皮下接种BRJ87细胞建立相应模型。SonoSite彩超显示单纯荷瘤组及复合模型组小鼠均可检出膀胱癌皮下移植瘤,其体积随时间的延长而逐渐增大,且两组间差异显著(P＜0.05);ELISA法、流式细胞术显示单纯免疫重建组及复合模型组小鼠外周血可检出人IgG、人T淋巴细胞,其表达量也随时间的延长而逐渐提高;Real-time PCR及免疫组化显示单纯荷瘤组及复合模型组小鼠脾脏、移植瘤中均可检出人T淋巴细胞的表达;而复合模型组小鼠外周血人T淋巴细胞的增殖、分泌活性及对膀胱癌细胞的凋亡诱导效应均与健康成人对照组差异无显著性(P≥0.05)。提示成功建立了人免疫重建荷人膀胱癌SCID小鼠复合模型。
　　 4.单抗偶联靶向超抗原SEA体内抗膀胱肿瘤实验研究
　　 将人免疫重建荷人膀胱癌SCID小鼠分对照组、SEA组及单抗靶向SEA实验组,分别予以PBS、SEA及单抗靶向SEA瘤周注射,SonoSite彩超检测显示单抗靶向SEA组小鼠皮下移植瘤体积、瘤体血流均显著小于对照组及SEA组。提示单抗靶向SEA可进一步减少膀胱癌皮下移植瘤瘤体血流,对其生长呈更强大的抑制作用。