表达ESAT-6-gpi和IL-21的B16F10瘤苗诱发抗肿瘤效应与机制研究

摘要

肿瘤基因工程疫苗是在研的常用肿瘤疫苗形式之一,其能通过基因工程技术,将不同的目的基因,如细胞因子、辅助刺激分子、主要组织相容性复合体-Ⅰ(MHC-Ⅰ)类分子等导入肿瘤细胞,接种后改变局部微环境,增强抗原提呈细胞(A-PC)和肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性,解决了传统肿瘤细胞疫苗免疫原性弱,难以诱导有效的抗肿瘤免疫应答的弊端。恶性黑色素瘤早期即易发生转移,手术治疗效果不理想,对常规化疗、放疗也不敏感,但由于其具有免疫原性,可进行免疫治疗。本研究向小鼠黑色素瘤B16F10细胞内导入白细胞介素-21(IL-21)和糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)修饰的6kD结核杆菌早期分泌靶抗原(6kD early secretary antigenic target,ESAT-6)基因制成小鼠黑色素瘤瘤苗,膜表达“人工标记异种抗原”ESAT-6,并在接种部位分泌表达IL-21,诱导机体产生抗肿瘤免疫应答。具有强免疫原性的ESAT-6借助GPI锚定表达于瘤苗细胞表面,刺激机体产生的抗体通过补体介导的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)作用杀伤瘤苗,释放抗原物质和凋亡的瘤苗促进树突状细胞(DC)对肿瘤抗原的摄取和提呈,打破机体对原发肿瘤的免疫耐受,诱导产生细胞毒T淋巴细胞(CTL)肿瘤特异性免疫应答,通过细胞毒作用杀伤表达ESAT-6的瘤苗细胞。ESAT-6只存在于瘤苗细胞,当瘤苗被清除后,ESAT-6的作用即停止,其副作用较小,而此时抗肿瘤免疫应答已经通过ESAT-6的引导作用而建立起来。瘤苗分泌的IL-21可增强荷瘤鼠CTL、自然杀伤细胞(NK)细胞等抗肿瘤活性。瘤苗膜表达的ESAT-6和分泌表达的IL-21分别以不同机制共同发挥诱导抗肿瘤免疫应答作用。
　　 目的:研制膜表达ESAT-6-gpi、分泌表达IL-21的B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗,评估其诱导的抗肿瘤免疫效应,并分析其作用机制。
　　 方法与内容:
　　 1.构建plRES-.ESAT-6-gpi/IL-21重组质粒,用其转染B16F10细胞,G418加压培养,应用单克隆和RT-PCR方法筛选出稳定转染的单克隆细胞株,检测其ESAT-6和IL-21的表达及其功能,合格的单克隆细胞做为瘤苗。
　　 2.应用米托蒽醌(MIT)处理B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗,确保瘤苗应用的安全性和有效性。以pIRES-ESAT-6-gpi核酸疫苗免疫小鼠,检测pIRES-ESAT-6-gpi核酸疫苗免疫对B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗协同抗肿瘤免疫效应及分析其效应机制。
　　 3.通过小鼠致瘤实验评估B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21活瘤苗的安全应用剂量。用B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21活瘤苗免疫小鼠,评价其诱导的体液和细胞免疫功能,观察其诱导的抗肿瘤免疫效应,并通过检测活瘤苗免疫对肿瘤细胞上皮.间质转化(EMT)的影响,分析其抗肿瘤机制。
　　 结果:
　　 1.经过双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了pIRES-ESAT-6-gpi和pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21两个重组质粒,分别转染B16F10细胞后,筛选出了稳定转染的B16F10-ESAT-6-gpi和B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21单克隆细胞株,以能正确表达ESAT-6-gpi和IL-21且具有生物活性的克隆,做为实验用瘤苗。
　　 2.MIT可安全灭活B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗,使其停止增殖,短期内仍保持活力,表达IL-21,增强瘤苗免疫原性。瘤苗细胞凋亡后,膜表面的ESAT-6呈点簇状分布。pIRES-ESAT-6-gpi核酸疫苗免疫血清能够增强DC对膜表达ESAT-6瘤苗的摄取,并促进DC的成熟。plRES-ESAT-6-gpi核酸疫苗免疫可协同B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗诱导产生更强的针对野生型B16F10细胞的体液和细胞免疫反应,实验小鼠肿瘤生长减慢,生存期延长。
　　 3.以2×105个B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21活瘤苗免疫接种14只C57BL/6小鼠,60天内没有可见的肿瘤生长,具有可靠的安全性,并能拮抗B16F10细胞攻击,使肿瘤生长明显受到抑制,生长缓慢,生存期延长。B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21活瘤苗免疫诱导小鼠产生有效的抗肿瘤免疫应答,体现在血清抗ESAT-6抗体和IFN-γ水平增高,CDC活性增强,脾脏和淋巴结CD8+淋巴细胞比例上升,CTL和NK细胞活性明显增强。B16F10-ESAT-6-gpi-IL-21活瘤苗免疫还能使免疫鼠肺部肿瘤结节数量减少,致使荷瘤鼠黑色素瘤TGF-β1产生减少,促进miR-200c转录表达及下调ZEB1蛋白表达,从而防止免疫鼠黑色素瘤发生EMT,使其转移能力减弱。
　　 结论:
　　 膜表达ESAT-6-gpi和分泌表达IL-21的B16F10/ESAT-6-GPI-IL-21瘤苗的致瘤能力下降,安全性和免疫原性增加,能够诱导出有效的抗肿瘤免疫应答。ESAT-6作为“人工标记异种抗原”可增加B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗的抗原性,打破荷瘤宿主对黑色素瘤的免疫耐受,IL-21可作为瘤苗的有效佐剂分子,增强瘤苗免疫效果。本研究为新型黑色素瘤苗的研制提供了可供借鉴的方法和思路。