小鼠骨髓源内皮祖细胞导向自杀/内皮抑素基因治疗肝癌的研究

摘要

第一部分CD和ES基因慢病毒表达载体的构建与鉴定
　　 目的:分别构建携带胞嘧啶脱氨酶（Cytosine Deaminase，CD）和血管内皮抑素(Endostatin，ES)基因的慢病毒载体，为进一步进行CD、ES基因治疗肝癌奠定基础。
　　 方法:根据GeneBank提供的大肠杆菌源CD和ES基因序列设计、合成两个基因并构建与荧光蛋白融合的真核表达载体pEGFP-CD和pDS-RED-ES。酶切和测序鉴定后，将载体瞬时转染HEK293细胞。运用Real-Time PCR检测CD和ES基因表达情况。把载体中基因片段EGFP-CD和DS-RED-ES通过BP/LR重组分别构建慢病毒载体，并利用293T细胞进行慢病毒的包装;将病毒原液浓缩，并测定病毒滴度。
　　 结果:酶切和测序、PCR鉴定证实构建出了慢病毒载体pLenti6.3-CD-EGFP和pLenti6.3-ES-Monomer-DsRed，感染293T细胞后荧光显微镜下观察到GFP和DsRed的表达，浓缩慢病毒滴度分别为2.2*108TU/ml和6.5*107TU/ml。
　　 结论:成功构建了CD和ES基因慢病毒表达载体。
　　 第二部分小鼠骨髓源性内皮祖细胞培养鉴定及7.0T磁共振成像研究
　　 目的:应用纳米磁粒子Resovist体外标记小鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs)，磁共振(MR)对标记细胞成像。
　　 方法:分离小鼠骨髓单个核细胞，内皮细胞培养液诱导培养。免疫荧光及qPCR检测培养细胞表面标记CD31、KDR、vWF表达，免疫荧光检测内吞Di I标记的乙酰低密度脂蛋白(Di I—AcLDL)和结合F I T C标记的荆豆凝集素(—)1(FITC—UEA—1)的功能，观察细胞体外基质胶中成管情况。Resovist体外标记EPCs，普鲁士蓝染色显示细胞内铁。利用7.OT MR进行快速小角度激发(Fast Low Angle Shot，Flash)2D-FLASH序列和多自旋回波序列(multislice，multiecho，MSME)及不同数量级标记细胞群成像。
　　 结果:免疫荧光及qPCR显示培养细胞表达内皮细胞标志CD31、KDR、vWF，能结合UEA、内吞LDL，体外基质胶上可以形成管状结构。Resovist细胞标记率接近100％，普鲁士蓝染色铁染细胞胞浆为蓝色、胞核为红色。MRI显示标记Resovist的细胞群较未标记者T2*梯度回波序列信号降低，2D-FLASH序列较MSME序列对单细胞成像检测更敏感。
　　 结论:小鼠骨髓源单个核细胞体外可以诱导培养为内皮祖细胞，Resovist能成功标记EPCs，利用MR可以对标记细胞群成像，可用于进一步细胞治疗及实时活体监测。
　　 第三部分小鼠骨髓源性内皮祖细胞导向自杀/内皮抑素基因治疗肝癌的研究
　　 目的:细胞法制作小鼠肝癌模型，慢病毒载体Lenti6.3-CD-EGFP、Lenti6.3-ES-Monomer-DsRed体外转染小鼠骨髓源性EPCs，SPIO标记后回输肝癌小鼠。探讨内皮祖细胞导向自杀/内皮抑素基因治疗肝癌的可行性。
　　 方法:体外培养、扩增小鼠骨髓源性EPCs，慢病毒载体Lenti6.3-CD-EGFP、Lenti6.3-ES-Monomer-DsRed转染、SPIO标记EPCs。观察体外基质胶上细胞成管功能、Millicell细胞迁移小室中细胞迁移能力、CCK-8法检测各组细胞培养上清对小鼠肝癌细胞H22增殖能力影响。细胞法制作小鼠肝癌模型，尾静脉注射DID标记EPCs至肝癌小鼠及正常小鼠后不同时间对离体组织进行光学成像观察EPCs体内迁移情况。尾静脉注射负载自杀/内皮抑素基因的EPCs至肝癌模型鼠。实验分为5组:第1组为移植EPCs+SPIO+LV组，第2组为移植EPCs+SPIO+CD/5-FC组、第3组为EPCs+SPIO+ES组、第4组EPCs+SPIO+CD+ES组和第5组EPCs+SPIO+CD/5-FC+ES组。实验动物在移植前及移植后7d、14d、21d三个时间点分别随机取2只进行MR扫描，根据MR图像绘制肿瘤生长曲线;进行组织病理学分析、生存分析。
　　 结果:慢病毒载体Lenti6.3-CD-EGFP、Lenti6.3-ES-Monomer-DsRed转染小鼠骨髓源性EPCs后荧光显微镜下分别可见细胞呈绿色、红色荧光，共转染后为橙色荧光。EPC+CD+ES组在体外基质胶上成管数及迁移小室中细胞迁移数量均明显少于EPC组; EPC+SPIO+CD/5-Fc+ES组细胞上清较EPC及EPC+SPIO+LV组上清液对小鼠肝癌细胞H22体外增殖具有明显抑制作用。DID标记EPCs后光学成像显示EPCs尾静脉注射后短期内主要分布于肝，少量依次分布于脾、肾、肺等组织。5组细胞分别通过尾静脉回输肝癌小鼠后，EPC+SPIO+CD/5-Fc+ES组较EPC+SPIO+LV组及其他治疗组小鼠肝癌肿瘤体积小、增长速度慢，中位生存期延长;肿瘤组织内CD31阳性细胞数量明显少于EPC+SPIO+LV组、凋亡细胞数量明显多于EPC+SPIO+LV组。
　　 结论:负载CD、ES基因的EPC体外可以杀伤小鼠肝癌细胞H22、抑制其增殖，尾静脉回输后可以归巢于肿瘤组织，抑制肿瘤生长、延长肿瘤小鼠中位生存期。

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声明

摘要

英文缩略语名词对照表

前言

综述

第一部分

1．材料和方法

2 实验方法

3、结果

4、讨论

5、小结

第二部分

1．仪器、耗材和实验试剂

2．实验方法

3．实验结果

4、讨论

5、小结

第三部分

1、仪器、耗材和实验试剂

2、实验方法

3、结果

4、讨论

5、小结

参考文献

博士在读期间发表文章

致谢