2009～2011年江苏季节性H3N2流感流行和病毒分子特征研究

摘要

研究背景与目的
　　甲型流感病毒基因变异活跃，能够形成全球大流行，严重危害人群健康。除流感大流行外，季节性流感(季节性H3N2、季节性H1N1、甲型H1N1和B型流感)每年造成极大的疾病负担，基因突变特别是抗原漂移使其不断逃避宿主既有的免疫作用，使得其预防和控制更加困难。
　　一方面，作为最主要的季节性流感毒株，H3N2亚型病毒造成的流感病例比H1N1亚型和B型流感多，病例症状较重。近几年H3N2亚型流感病毒在我国西北、北部及中南部地区都有传播，传播方向由南方向北方，以秦岭、淮河为界，南方地区流感流行高峰主要在6～8月，北方地区流感流行高峰主要在12月至次年1月。流感样病例(Influenza-Like Illness，ILI)监测可以更好地了解其发病和优势毒株变化情况。另一方面，病毒基因变异复杂多样，H3N2亚型病毒拥有相对较快的进化速率，且同一流行季节的H3N2病毒可呈现基因分化现象，基因水平的研究可以揭示病毒的进化特点。
　　世界卫生组织(World Health Organization，WHO)开展长期的流感监测，以掌握每个季节的优势流感病毒及其最新变异，为分析抗原变化、研制疫苗和解释流感长期进化方向提供数据信息。我国华南地区被认为是全球流感大流行的发源地，且东亚和东南亚地区是全球季节性H3N2流感病毒传播的网络中心，开展流感监测意义重大。本课题以江苏省为研究现场，监测2009～2011年间流感病例，通过对ILI及其病毒感染情况进行分析，了解季节性流感发病特点、优势毒株变化及流行特征，为流感防制提供科学依据。并开展具代表性的季节性H3N2流感分离毒株的全基因组测序和分析，了解此3年间季节性流感病毒基因的变异情况和遗传进化规律，为江苏省乃至全国境内的季节性H3N2流感疫情防控工作开展提供详实可靠的信息依据。
　　研究内容与方法
　　流行病学监测
　　研究内容通过流感网络实验室，搜集2009年1月～2011年12月间ILI的咽拭子样本，通过细胞培养分离流感病毒，对培养物进行毒株鉴定确定流感病毒的型别并鉴定甲型流感病毒的亚型。搜集ILI的流行病学信息，构建关于病毒核酸检测结果和流行病学资料的数据集。对数据进行统计分析，检验不同性别、地区、年龄组ILI阳性率之间的差异，计算不同月份ILI报告数量、流感病毒阳性率和不同类型病毒检出数量，描述流感流行高峰期和优势毒株变化情况。
　　研究方法 ILI的采集：2010年9月以前，每家哨点医院每周采集20～30份标本；10月后，《全国流感监测方案(2010版)》调整到每周每家哨点采集5～15份标本；所采集的ILI标本被送至所在辖区流感监测网络实验室。ILI样品的病毒分离：采用MDCK(Madin Darby Canine Kidney)细胞接种培养。核酸鉴定：病毒核酸提取物的荧光定量PCR检测(QIAGEN公司的One-StepRT-PCR试剂盒或硕世公司的甲/乙型流感病毒鉴定试剂盒)。病例信息采集：专用的ILI调查表。数据的录入：由各实验室的流感监测人员将流感病例信息及样品检测结果上报至“中国疾病监测系统”，自动生成数据集。统计分析：Excel软件用于导出数据和制作图表，PASW Statistics18软件用于计算阳性率和卡方检验。
　　全基因组特性研究
　　研究内容依据流感病毒全基因测序成本和流感专家意见，选取部分2009～2011年间的H3N2亚型流感毒株作为测序样本。培养病毒获取高滴度病毒液，提取病毒RNA并将其逆转录为互补DNA(cDNA)；扩增8个基因片段并对PCR产物测序。以WHO推荐的北半球季节性H3N2疫苗毒株为参考株，分别构建每个基因开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)序列的系统发生树；由核苷酸序列推导出相应蛋白质的氨基酸序列，分析各个蛋白的氨基酸位点。
　　研究方法样本选取：采取方便抽样原则。确定季节性H3N2流感病毒的检出数量的高峰期和散发期，在两期内选取病毒分离株，且每年至少选取1株病毒。病毒增殖：采用MDCK细胞传代培养，使得病毒的滴度大于1:8。基因片段扩增：采用Viral RNA Extraction Kit(QIAGEN)提取病毒的RNA，采用SuperScriptⅡ Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen)进行逆转录，自行设计扩增片段长度小于1000bp的引物，采用LA-Taq DNA Polymerase(TaKaRa)试剂盒扩增基因片段。DNA测序：PCR产物凝胶回收→纯化→染料标记→上机电泳测序(AppliedBiosystem3730测序仪)。序列整理和分析：从测序仪导出序列结果，从NCBI数据库下载参考株序列，使用DNAStar软件进行序列比对、剪切、反向互补变换和拼接；使用MEGA软件对核苷酸序列进化树构建和验证以及氨基酸序列推导，比较所测毒株和参考株的相关位点。
　　研究结果
　　流行病学监测
　　共受理标本69774例，核酸阳性标本约占19.7％。季节性H1感染210例(1.5％)，甲型H1N1感染6178例(45.0％)，季节性H3感染3479例(25.4％)，B型流感感染3531例(25.7％)，甲型其它亚型感染322例(2.3％)。不同性别ILI的阳性核酸检出率差异无统计学显著性，不同年龄组、实验室的ILI阳性核酸检出率差异具统计学显著性：10～30岁年龄组ILI的阳性检出率相对较高，常州市疾控中心的ILI病毒阳性率相对较高。9月份至第二年4月份间为阳性率高峰期，季节性H3N2、新甲型H1N1和B型的顺序交替成为江苏省2009年6月～2011年6月间的优势毒株，B型流感成为2011年4月后的优势流行毒株。
　　全基因组特性研究
　　共选择19株病毒，涵盖3年、两地域和两发病期。其中6株病毒分离于(甲型H1N1暴发)前，13株病毒分离于2009年4月后，具体时间为：2009年(12株)、2010年(6株)和2011年(1株)；淮河以北地区(9)、南部地区(11)，检出高峰期(12)和散发期(7)。
　　通过接种于MDCK细胞，培养得到病毒液的血凝效价均大于1:8，PCR扩增得到全部毒株8个片段的扩增产物，所选毒株8个基因片段的编码序列全部测通，通过分析基因进化树和氨基酸序列，掌握了病毒的基因变异情况，具体结果为：
　　相比疫苗毒株，19株病毒的各个RNA片段的编码序列未出现核苷酸的插入和缺失。每个基因ORF核苷酸序列的平均差异率从大到小依次为：HA1>HA、PB1-F2>NA>PB1>PB2>PA、NS1>NP>M1、NEP>M2。综合8个片段进化树，将全部毒株分为5个分支Clade1～5，每个分支内的毒株同源性较高。Clade1包括6株2010年的毒株，Clade2包括除A/JSBT/123/2009(H3N2)外5株2009年分离于无锡的毒株，Clade3包括3株疫苗毒株，Clade4包括A/Nanjing/1/2009和2011年分离于镇江的毒株，Clade5包括6株2009年分离子徐州的毒株，A/JSBT/123/2009(H3N2)在不同的进化树上的位置变化较大。另外，Clade1～5间的同源性在不同的进化树上存在一定差异。
　　特征性位点：PB1的宿主特异性位点发生S375G变异。相比A/Perth/16/2009，20株病毒在HA蛋白的抗原决定簇变异总数从1到8个，发生在A、B区位点差异主要包括K144N、L157S、N158K、K159S、K189N；发生在C、D、E区的位点差异主要包括E50K、V213A、S214I、K62E、260M、R261Q。受体结合位点：A/JSBT/123/2009的第225位氨基酸天冬酰胺N突变为天冬氨酸D。糖基化位点：9～12个不等，变异包括45SSS→NSS、122NES→NEN和144KNS→NNS。二硫键：Nanjing/1655的305为精氨酸(R)，其不能与281C形成二硫键，使得二硫键数目减少。相比疫苗株A/Perth/16/2009，20株病毒N2的3个抗原位点的变异数目从0到3个不等，主要变异包括G401D、D196N、D197N、L338F、N342D、S367N和K369T。NA蛋白酶活性中心：未变异。糖基化位点：7～9个不等，变异包括367SEK→NET、402NRS→DRS、146NNT→NNI和402NRS→DRS、151DRT→NRT和151DRT→NRT。
　　M1蛋白的“CCHH锌指结构基序”未见变异。20株病毒的M2蛋白发生耐药性突变(S31N)，A/JSXZ/2257/2010的G16E位于宿主特异性位点。V21I位于NS1蛋白RNA结合域，S135N，D139G，A155V，V157A，R140Q和L141I位于NS1效应区，PL基序由RSKV变异为RSKI和RSEV。部分毒株在PB1-F2蛋白的25位氨基酸缺失。
　　其他变异位点：包括PB2的K353R、V480I、R355K、A569T、I63V、I461V、L7F、V67I、N137S、M473V、V560I，PB1的I10L、K52R、L576I、T57I、V200I、S384P、T528A、A587T，PA的I354V、I348V、S332T、K361R、K716N，HA的Y105H、P162S、V223I、R261Q、R269KNP：I136M、V197I、G450S/N，NA的D127N、I307M、R430S，M1的R174K、M244RM2的W15G，NS1的P85L、P164H、V111M、P212S、S135N、D139G和V230I，NEP的S44L、L87S、R88K，PB1-F2的E4G、T16I、K21G/E、N34S、P62L、R85K、G87E。
　　结论
　　流行病学特征
　　低年龄组(10～30岁)和常州市疾控中心的阳性核酸检出率相对较高，阳性率和阳性病例检出量的高峰值相一致，都位于9月份至第二年4月份间。结合阳性病例数量和阳性检出率，对流感疾病负担较重的组别加强预防控制。新甲型H1N1、季节性H3N2和B型流感病毒成为未来几年该地区的优势流行毒株，季节性H1N1病毒在未来的检出数量可能维持低水平。2009和2010年是季节性H3N2的流行期，高发期位于7～11月，2011年呈散发。
　　分子特征
　　基因进化特征表面蛋白HA、NA和非结构蛋白PB1-F2拥有较高的氨基酸变异率，其面对的宿主正向选择作用强于其他基因。进化树上不同毒株按照Clade1～5的分支结构聚类，依据毒株分离日期和季节性H3N2流行期和散发期，认为不同时间点分离的毒株群间存在基因差异，尤其在流行期和散发期所分离毒株之间。同一地区内的分离株间基因也呈现差异：6株无锡毒株均位于2009年的散发期中，A/JSBT/123/2009(H3N2)的基因特征和其他5株病毒的进化特点不一致，它们的PB2、PA、HA和NA片段同源性较高，而片段PB1、NP、M和NS的同源性较低。不同片段的进化树结构本身存在差异，但尚不能判断是否发生“片段重配”现象。
　　表面蛋白的特征性位点全部7株2010～2011年间病毒中，除A/Nanjing/1654/2010外的6株病毒HA蛋白的抗原决定簇变异总数均大于4个，可能与疫苗毒株存在抗原性差异，但需结合抗原性试验。A/JSBT/123/2009的N225D可能影响病毒对宿主受体的识别。A/Nanjing/1655/2010的二硫键数目减少，影响空间结构的维持。6株无锡毒株和1株2011年毒株糖基化位点大于10个，2株南京地区2010毒株为9个，可影响宿主免疫细胞对病毒的识别。
　　宿主特异性位点这些位点相对保守，本研究未见PB2和PA基因相关位点变异，但10株病毒PB1宿主特异性位点发生变异S375G，毒株A/JSXZ/2257/2010的M2基因宿主特异性发生变异G16E。这些突变的意义有待进一步解释。
　　耐药位点未见NA蛋白酶活性中心的神经氨酸酶抑制剂耐药位点变异，表明毒株普遍对NI敏感；20株病毒的M2基因发生耐药性突变(S31N)，毒株普遍对金刚烷胺类药物耐药。
　　毒力因子作为流感病毒重要的毒力因子，NS1蛋白RNA结合域和效应区及PL基序的变化可能影响部分毒株的毒力。5个2010年毒株PB1-F2蛋白的26位氨基酸处发生了缺失，导致其蛋白断裂，虽然MTS序列内的氨基酸变异，但25aa长度的PB1-F2缺失MTS序列，相应功能可能受到影响。
　　其他位点至少出现在两株不同毒株的其他变异位点数目众多，有待进一步研究以解释季节性H3N2流感病毒的基因进化特征。