联合应用靶向VEGF-A、Ang-2的shRNA抑制子宫内膜癌生长的体内外实验

摘要

目的子宫内膜癌发病率呈逐年增高趋势，严重影响女性生命健康，因此探讨子宫内膜癌治疗的新措施具有重要的意义。目前大量研究表明在子宫内膜癌肿瘤内VEGF-A、Ang-2等血管生成因子表达升高，且与肿瘤的生长及转移等有密切的关系。本研究构建靶向VEGF-A和Ang-2的shRNA，采用分子生物学技术验证其在子宫内膜癌细胞株Ishikawa细胞中的治疗有效性，并建立子宫内膜癌Ishikawa细胞裸鼠皮下移植瘤模型，进一步证实了联合应用靶向VEGF-A和Ang-2的shRNA显著抑制子宫内膜癌移植瘤的生长，为子宫内膜癌的靶向抗血管生成治疗提供依据。
　　方法体外培养子宫内膜癌Ishikawa细胞株，利用脂质体介导shRNA VEGF-A和shRNA Ang-2转染入细胞，以无义随机序列构建的阴性质粒组作为对照，实时定量PCR技术检测VEGF-A、Ang-2 mRNA表达水平的变化；Western blot技术检测VEGF-A、Ang-2蛋白质表达的变化；MTT法检测VEGF-A、Ang-2下调后对细胞增殖能力的影响；Annexin V-PE双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡情况；Transwell肿瘤侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。建立子宫内膜癌Ishikawa细胞裸鼠皮下移植瘤模型，给予shRNAVEGF-A联合shRNA Ang-2治疗，Western blot技术检测瘤体中VEGF-A、Ang-2蛋白质表达的变化，免疫组化检测微血管密度，各组织器官HE染色观察毒副作用及肿瘤转移情况。
　　结果在体外实验中，与空白对照组和阴性质粒组相比，VEGF-A干扰组、Ang-2干扰组、联合干扰组都能从mRNA水平、蛋白水平下调Ishikawa细胞中靶基因的表达。各干扰组都能有效地抑制Ishikawa细胞生长增殖能力和侵袭能力，其中联合干扰组抑制效果更显著，各组对细胞周期和凋亡无明显影响。
　　在体内试验中，与空白对照组和阴性质粒组相比，VEGF-A干扰组、Ang-2干扰组、联合干扰组下调裸鼠皮下移植瘤内靶基因的蛋白表达，各干扰组移植瘤内微血管密度下降，移植瘤生长得到有效抑制，其中联合干扰组移植瘤肿瘤体积抑制最显著。
　　结论在体外实验中，shRNA VEGF-A联合shRNA Ang-2转染有效抑制了Ishikawa细胞的生长增殖及侵袭能力；体内试验中，shRNA VEGF-A联合shRNA Ang-2给药显著抑制了Ishikawa细胞裸鼠皮下移植瘤中VEGF-A、Ang-2蛋白质表达，抑制移植瘤体内微血管密度，从而抑制肿瘤生长。