P物质在牙周组织中的表达及炎症过程中的意义

摘要

该研究采用组织块法体外培养人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF),进行形态学、免疫组化染色(ABC法)的细胞鉴定;激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)检测加入SP后HGF胞内游离钙浓度的变化情况,分析SP在牙周炎症进程中的作用;采用放射免疫分析法测定牙周健康者和牙周炎患者磨牙区龈沟液(gingival crevicular fluid,GCF)间SP含量的差异,进一步分析SP含量与牙周炎组织破坏程度间的关系.一、组织块法体外培养人牙龈成纤维细胞【材料和方法】随机选择南京医科大学附属口腔医学院外科门诊就诊因正畸或阻生需要拔牙的患者,在志愿者完全知情同意下,对拔牙创以最小的创伤取少量牙龈组织.将取得的牙龈组织在无菌条件下剪成1mm×1mm×1mm大小,置于培养瓶,加入适量含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液,于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养.0.25%胰酶消化法进行传代,细胞传代至第3代,行细胞爬片.采用免疫组化染色(IHC)进行细胞鉴定,以确认培养的细胞为人牙龈成纤维细胞.二、P物质对牙龈成纤维细胞胞内游离钙浓度的影响【材料和方法】取前法培养的人牙龈成纤维细胞,继续培养至第4代,经胰酶消化法消化细胞,调节细胞浓度为105/L,接种于六孔板,每孔底预置一片24mm×24mm盖玻片,继续培养24h,待测.避光条件下加入荧光探针Fluo-3/AM标记细胞,置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上.加SP药液到盖玻片,使细胞外最终药液浓度为10<'-7>mol/L,选择贴壁良好的活细胞进行观察.采用激光扫描共聚焦显微镜对细胞加入SP前后进行动态扫描,激发波长488nm,发射波长520nm.对扫描得到的荧光图像进行分析,得到反映细胞内游离钙浓度在SP刺激下动态变化的曲线.三、牙周健康者及牙周病患者龈沟液中SP的检测及意义【材料和方法】随机选择南京医科大学附属口腔医学院牙周科门诊中等程度的成人牙周炎患者15例.在患者口内各选一个健康、牙龈炎、牙周炎牙位收集GCF样本.对照组健康个体15例,临床无牙龈及牙周炎症.用不同体积的血清浸润20×2mm的滤纸条,得到滤纸浸润长度与GCF体积之间的标准回归方程.用洁治器小心去除待取样本区域龈上菌斑、牙石,将滤纸条轻插入龈沟内,30秒后取出,测量浸润面积,得到GCF体积.将该滤纸条放入450 μ 1 pH7.2的冷冻0.01M磷酸钠缓冲液中,内含0.15M氯化钠,震荡30秒,存于-80℃冰箱待用.GCF样本加入放射性标记物125Ⅰ-SP进行放射免疫分析,沉淀部分采用γ计数仪进行计数.所有样本采用复管分析.所测得结果的处理采用单因素方差分析.

目录

前 言

第一部分组织块法体外培养人牙龈成纤维细胞

第二部分P物质对牙龈成纤维细胞胞内游离钙浓度的影响

第三部分牙周健康者及牙周病患者龈沟液中SP的检测及意义

研究小结

参考文献

附 录

致 谢

综 述：P物质在牙髓、牙周组织中的分布及意义