人致癌物代谢酶及其自然变异体的功能研究

摘要

本研究以生物化学手段(酶反应学)和细胞及分子生物学手段侧重研究了CYP2A13对AFB1的代谢活化能力及其功能，并与传统的AFB1代谢酶CYP1A2进行比较，研究结果证明了CYP2A13是一种全新的、高效的AFB1代谢酶，这不仅为AFB1可诱发人肺癌提供了机理上的有力证据，而且为今后寻找CYP2A13特异性抑制剂并利用它们对AFB1所致肺癌进行化学预防提供了理论基础。主要研究结果如下： 1.运用Sf9昆虫细胞成功地在体外表达了人CYP2A13蛋白，免疫印迹结果显示，CYP2A13蛋白在约55kD附近显示一条强带，而对照蛋白(仅表达载体)则无此条带；CYP2A13蛋白在波长为450nm处显示特征性的吸收峰。 2.体外酶反应动力学结果显示，CYP2A13代谢AFB1可生成包括具有毒性和致癌活性的环氧化物AFB1-epoxide和AFM1-epoxide在内的多种代谢产物，而对照蛋白则没有。与传统的AFB1代谢酶CYP1A2相比，在15μM和150μMAFB1浓度下，CYP2A13代谢AFB1生成的AFM1-epoxide与CYP1A2基本相当，AFB1-epoxide为CYP1A2的三分之一，CYP2A13尚代谢生成许多未知的代谢产物。虽然CYP2A6也被认为是AFB1的代谢酶，但本研究结果显示，在15μMAFB1浓度下，CYP2A6无代谢活性；即使在150μM浓度下，也未检测到AFB1的环氧化代谢产物。 3.运用Flp-In系统在CHO细胞成功地建立了稳定表达CYP2A13蛋白的转染细胞株(CHO-2A13)。Flp-InCHO是一个经过改造过的细胞株，由于在CHO染色体上植入了FRT位点，运用特殊的载体(pcDNA5/FRT)可以保证所转染的cDNA仅以单拷贝的方式插入到染色体的固定位点，避免了在一般的细胞转染时通常存在的插入位点和拷贝数的不确定性，从而保证了转染不同的cDNA都具有相同的蛋白表达效率，为比较不同蛋白的代谢活性提供了可靠的保证。研究结果显示，尽管CYP2A13和CYP2A6在CHO细胞中具有相同的表达水平，但AFB1对两者的细胞毒性(LC50)相差了1000倍(40nMvs40μM，48小时)；与CHO-CYP1A2相比，其细胞毒性也相差了近6倍(220nMvs1.2μM，24小时)，而对CHO-CYP3A4的LC50至少为50μM。AFB1对CHO-CYP2A13的细胞毒性不仅具有剂量依赖性，而且呈时间依赖性。 4.通过对细胞周期的研究发现，AFB1阻断CHO-2A13细胞分裂(G2/Marrest)呈剂量依赖性(24小时)，而CYP1A2和CYP2A6仅在高剂量时，G2/Marrest与对照相比具有显著性；AFB1染毒48小时，不仅CHO-2A13的细胞分裂受到破坏，其DNA合成(Sarrest)也受到明显影响，而此刻仅CHO-1A2在高剂量时表现为G2/Marrest的升高。对细胞周期的影响可能与AFB1被CYP2A13代谢所形成的环氧化物与细胞DNA形成加合物并进而导致的DNA损伤有关。 5.运用三种典型的化合物进一步观察CYP2A13代谢活化AFB1的方式。丙烯酰胺不能被CYP2A13代谢也不引起细胞毒性，尼古丁可被CYP2A13代谢但不能引起细胞毒性，NNK既可被CYP2A13代谢也可引起细胞毒性。让这三种化合物分别与AFB1共同处理CHO-2A13观察它们的细胞毒作用。结果显示，丙烯酰胺对AFB1所致的细胞毒作用无任何影响；尼古丁可剂量依赖性的抑制AFB1的毒作用，在100μM时几乎完全抑制了AFB1的毒作用，这可能与尼古丁和AFB1在CYP2A13上具有共同的作用靶点，两者竞争作用的结果；NNK对AFB1的影响在低剂量时更符合单独作用或相加作用的方式，等效剂量(20﹪的细胞死亡率)的NNK和AFB1可引起约40﹪的细胞死亡，这也符合各自的细胞毒作用机理，即两者都是通过引起DNA损伤而对细胞产生毒作用，当然高剂量的联合作用方式还需研究。 6.运用pcDNA5/FRT/V5-HisTOPO载体直接构建了CYP2A13质粒，该质粒的特点是在CYP2A13蛋白的C段带有一段V5-His的多肽。有趣的是该多肽大大降低了CYP2A13代谢活化AFB1的能力，这种作用也同样表现在另外一种黄曲霉毒素AFG1上。虽然CYP2A5的代谢活化能力比CYP2A13强，但V5-His多肽对其功能几乎无影响。此外，AFB1的代谢产物之一AFM1也被用来比较对CHO-2A13的毒作用，结果发现AFM1的毒性远低于AFB1和AFG1，这是否意味着AFM1是AFB1的解毒性产物，相关研究有待进一步开展。 7.通过比较CYP2A6和CYP2A13两种蛋白的差异以及运用计算机模型对其蛋白质空间结构的分析，运用点突变技术人工构建了两种可能对CYP2A13的活性产生影响的突变体Val117和Arg372。Val117代谢AFB1产生的环氧化代谢产物比野生型的多，而Arg372则完全丧失了活性；细胞毒性也显示了相似的结果，AFB1对CHO-Val117的毒作用比野生性强5倍左右，而在相同条件下对CHO-Arg372几乎无作用。实验结果与实验室过去研究的该两种突变体对NNK的代谢活性完全一致，进一步证实了＃¨7和＃372两个位点的突变对CYP2A13活性的影响。 8.制备了CYP2A13特异性抗体，并运用体外表达的CYP2A5、CYP2A6、CYP2A13、CYP3A4蛋白以及大鼠肝脏微粒体蛋白对其特异性进行了评价，结果发现CYP2A13抗体仅与CYP2A13蛋白结合，与其他蛋白质无作用；而CYP2A6抗体(可与CYP2A5和CYP2A13有交叉反应)则能与CYP2A5、CYP2A6、CYP2A13蛋白结合，且肝脏微粒体蛋白也呈阳性反应；研究结果充分显示了CYP2A13抗体的特异性。此外，运用免疫组化方法检测了人正常呼吸道组织及嗅觉上皮细胞中CYP2A13的表达，结果发现CYP2A13在肺气管和支气管上皮有很强的表达，而在肺泡中的表达则很弱，这与已报道的CYP2A13mRNA可在呼吸系统组织中被检测到的结果完全一致，进一步证明了CYP2A13蛋白在呼吸系统中的表达；CYP2A13还在大脑嗅觉上皮细胞中高度表达，这项结果将为研究烟草代谢物尼古丁与吸烟成瘾性的关系开辟新的重要途径。

目录

摘要

Section ⅠFunctional Characterization of CYP2A13 on AFB1 Metabolism

Introduction

1.Materials and Methods

2.Results

3.Discussion

References

Section Ⅱ Functional characterization of the missense genetic polymorphisims of human CYP2A13

Section Ⅲ Functional study on the genetic variants of NADPH cytochrome P450 oxidoreductase

Section Ⅳ Heterologous expression and substrate exploration of human cytochrome P450 2S1

Section Ⅴ Cytotoxicities of Acrylamide and its Metabolite Glycidamide on Flp-In CHO Exprressing Major Human Liver Cytochrome P450s

附录一 主要缩略语

附录二 主要技术路线

附录三 创新点及其重要意义

附录四 博士生在读期间已(待)发表的论文及获奖情况

附录五 支持本研究的基金

附录六 合作导师评语

致谢

论文独创性声明及论文使用授权声明