转染人骨形成蛋白2基因共培养条件下NIH3T3细胞生物学性状观察

摘要

本研究拟将人骨形成蛋白2真核表达载体pcDNA3.1-B2转染入小鼠成纤维细胞系细胞(NIH3T3细胞)，建立能稳定表达BMP2的细胞系，并利用细胞共培养系统Transwell，观察转基因诱导表达的分泌型BMP2对NIH3T3细胞骨化分化的影响。以探讨BMP2基因治疗在牙周组织工程方面的意义。 实验一pcDNA3.1-B2真核表达质粒的鉴定及稳定表达BMP2细胞系的建立 目的:通过转基因技术，建立稳定表达BMP2的成纤维细胞系。 材料和方法将:pcDNA3.1-B2用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后，经1﹪琼脂糖凝胶电泳鉴定，并检测其携带目的基因的核酸序列。将经过鉴定的pcDNA3.1-B2真核表达质粒通过高效的阳离子聚合物转染试剂转染入NIH3T3细胞中，并用G418筛选获得稳定转染细胞株。RT-PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测hBMP2基因的转录和BMP2蛋白在胞外的表达。 结论:通过转基因手段转染入hBMP2基因的成纤维细胞具有稳定表达BMP2蛋白的作用，并能分泌BMP2蛋白于胞外。 实验二转染hBMP2基因诱导表达的分泌型BMP2对成纤维细胞超微结构的影响 目的:观察转基因诱导表达的分泌型BMP2对成纤维细胞超微结构的影响。 材料和方法:利用Transwell共培养系统将NIH3T3细胞与转染hBMP2基因细胞(B2-3T3细胞)共培养十天后，下层NIH3T3细胞经3﹪戊二醛固定后制备超薄切片，再经醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后，利用透射电镜观察其超微结构的变化。 结论:转基因诱导表达的分泌型BMP2使成纤维细胞表现出骨细胞系细胞的超微结构特征，且细胞的分泌功能增强。 实验三转染hBMP2基因诱导表达的分泌型BMP2对成纤维细胞碱性磷酸酶活性的影响 目的:观察转基因诱导表达的分泌型BMP2对成纤维细胞碱性磷酸酶活性的影响。 材料和方法:利用Transwell共培养系统将NIH3T3细胞与转染hBMP2基因细胞(B2-3T3细胞)共培养十天后，超声破碎下层NIH3T3细胞，以对-硝基苯磷酸二钠为底物，在405nm处测定其碱性磷酸酶活性，将测定的OD值进行单因素方差分析和PostHocTests检验。 结论:转染hBMP2基因诱导表达的分泌型BMP2具有上调成纤维细胞碱性磷酸酶活性的作用。 实验四转染hBMP2基因诱导表达的分泌型BMP2对成纤维细胞骨化标志物骨钙蛋白表达的影响 目的:观察转基因诱导表达的分泌型BMP2对成纤维细胞骨化标志物骨钙蛋白表达的影响。 材料和方法:利用Transwell共培养系统将NIH3T3细胞与转染hBMP2基因细胞(B2-3T3细胞)共培养十天后，下层NIH3T3细胞用丙酮固定后，经SABC法免疫组化染色后观察其骨钙蛋白(OCN)的表达情况。 结论:转染hBMP2基因诱导表达的分泌型BMP2具有诱导成纤维细胞表达骨化标志物骨钙蛋白的作用。 综上所述，本研究采用阳离子聚合物转染试剂可将外源性hBMP2基因稳定转染入NIH3T3细胞。其分泌至胞外的BMP2蛋白具有诱导成纤维细胞骨化分化的能力。

目录

缩略词表

前 言

实验一pcDNA3.1-B2真核表达质粒的鉴定及稳定表达BMP2细胞系的建立

实验二转染hBMP2基因诱导表达的分泌型BMP2对成纤维细胞超微结构的影响

实验三转染hBMP2基因诱导表达的分泌型BMP2对成纤维细胞碱性磷酸酶活性的影响

实验四转染hBMP2基因诱导表达的分泌型BMP2对成纤维细胞骨化标志物骨钙蛋白表达的影响

结 语

参考文献

附 录大量质粒抽提和细胞内总RNA提取方法

个人简历

攻读硕士学位期间公开发表论文目录

致 谢

综 述骨形成蛋白诱导牙周膜前体细胞成骨分化的信号通路

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