安徽白山羊三种经济性状基因表达载体构建及CMV启动子优化研究

摘要

安徽白山羊是优良的地方品种，经过长期选育，形成了耐粗饲、适应性强、繁殖率高、肉和板皮质量优的优良特性。但是，该品种受其个体小、生长缓慢的影响，不适于广泛推广，迫切需要改良以提高其生长速度。目前，通过转基因育种提高其生长速度是改善其生产性能的重要途径之一。为了实施该育种途径，必须具有促进生长性能的基因及其高效的真核表达载体。基于这一需求，本论文在农业部转基因山羊育种重大专项的资助下，进行了安徽白山羊重要促生长基因的克隆和真核表达载体构建的研究。
　　本论文首先根据物种间基因序列的保守性，设计了从mRNA扩增生长激素(growthhormone，GH)、胰岛素样生长因子-Ⅰ（insulin-likegrowthfactor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）及生长抑素（somatostatin,SST）基因的PCR引物，之后从安徽白山羊的垂体、肝脏及胰脏组织中提取总RNA，反转录后作为模板，用所设计的特异引物成功扩增出三种目的基因片段，再将三种基因片段进行T克隆及测序。经确认的基因片段再接入真核表达载体pEGFP-N1，构建了pEGFP-N1-GH、pEGFP-N1-IGF-Ⅰ及pEGFP-N1-SST真核表达载体。之后，经菌落PCR、酶切及测序鉴定，成功构建三种基因的真核表达载体。为了检测三种真核表达载体的转基因可行性，用脂质体将三种基因的真核表达载体转染体外培养的安徽白山羊胎儿成纤维细胞，通过荧光显微镜直接观察和RT-PCR检测，确证目的基因GH、IGF-Ⅰ及反义SST在山羊胎儿成纤维细胞中表达，并筛选出稳定表达GH、IGF-Ⅰ基因以及SST反义基因的成纤维细胞克隆。基于上述实验，成功克隆了安徽白山羊三种重要的经济性状基因，即GH、IGF-Ⅰ和SST基因，并成功构建了其直接可用于转基因育种的真核表达载体，从而为安徽白山羊转基因育种提供了重要的遗传素材。
　　为了探讨可用于转基因育种的更高效的真核表达载体，本论文结合本实验室近年来进行的转录因子结合谱研究成果，对目前转基因育种中普遍使用的真核启动子——巨细胞病毒启动子(Cytomegaoviynspromoter，CMVpromoter)进行了序列改造，成功发展出两种具有不同转录时效的高启动活性启动子。转录活性检测分析表明，两种启动子都有较野生型CMV启动子更强的基因转录启动活性，可使绿色荧光蛋白报告基因在哺乳动物细胞中表达水平分别提高259.42％和164.67％。此外，研究表明两种人造启动子分别具有瞬时转染和稳定转染的不同应用价值。上述研究表明，成功发明了两种高效的人造真核启动子，这一研究成果具有很大的应用价值，可用于转基因动物育种、酶工程、制药工程等基因工程，同时可用于发展用于基础研究的报告构体(reporterconstruct)和转录因子诱骗子等生物医学药物分子。
　　综上所述，本论文成功克隆了安徽白山羊的三种重要促生长基因（GH、IGF-Ⅰ和SST），并成功构建了其直接可用于转基因育种的真核表达载体，为安徽白山羊转基因育种提供了重要的遗传素材。同时成功改造了两种高效人造真核启动子，为实施高效转基因动物育种提供了新的遗传工具。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 转基因山羊研究进展

1．2 家畜经济性状候选基因的研究进展

1．3 基因转移载体及转染技术研究进展

1．4 本论文的主要研究内容

第二章 GH、IGF-Ⅰ及SST基因克隆及真核表达载体构建

2．1 引言

2．2 实验材料

2．3 实验方法

2．4 实验结果

2．5 本章小结

第三章 GH、IGF-Ⅰ及SST基因转染胎儿成纤维细胞

3．1 引言

3．2 实验材料

3．3 实验方法

3．4 实验结果

3．5 本章小结

第四章 转基因载体CMV启动子的改造

4．1 引言

4．2 实验材料

4．3 实验方法

4．4 实验结果

4．5 本章小结

全文总结

参考文献

个人简介

致谢