固态纳米孔中DNA与线性病毒颗粒易位行为研究

摘要

单分子检测是对体系中单个分子的行为进行研究的一种检测方法，其具有最高灵敏度，也是低物质含量监测技术研究的一个里程碑。单分子检测可提供分子水平上分子统计与动态性质的差别，尤其是在生理条件下对生物大分子进行探测并提供分子结构和功能之间的信息，得到复杂体系中单个分子的性质分布。 基于纳米孔的单分子读取技术，其原理为，在电泳力驱动下单个分子逐一从纳米孔的一侧易位到另外一侧，通过检测阻塞电流值的变化从而实现单分子的检测。当纳米孔的孔径在非常狭窄的范围内时，仅允许单个核酸聚合物通过，从而产生单分子水平上的电流变化信号。研究者期望将这种纳米孔的单分子读取技术开发用于DNA测序技术，使得测序技术读取数据速度更快、降低测序成本，从而改变个体医疗的前景。虽然目前的纳米孔单分子测序研究并没有取得预期结果，但是它们至少显示出纳米孔在单分子技术方面的应用优势，例如高度的敏感性，同时也引起了纳米孔核酸分析技术的研究热潮。研究者开始对纳米孔检测技术用于纳米颗粒、病毒颗粒检测领域给予极大的关注和重视。这些研究结果使得科学家们更加坚信，纳米孔作为单分子检测技术的一个平台，一定会实现低成本的测序方法以及高灵敏的生物传感检测技术。 本课题研究了固态氮化硅纳米孔以及集成纳米电极的加工制备技术方法，随后对不同加工技术制备的固态纳米孔用扫描电镜或者高能透射电子显微镜进行表征，然后将固态纳米孔用于研究DNA与线性病毒颗粒的易位行为。本论文的研究成果主要包括以下几个方面: 1固态纳米孔的加工制备以及结合表面纳米电极研究 采用三种不同的微纳加工技术进行固态纳米孔的加工制备，包括聚焦离子束系统、透射电子显微镜和氦离子显微镜系统。首先利用半导体加工技术在硅晶圆上制备出用于刻蚀纳米孔的自支撑悬空固态氮化硅薄膜，这些薄膜可设计不同厚度。根据不同的实验要求，设计加工固态薄膜的厚度为20nm-100 nm。然后使用聚焦离子束系统在100 nm的氮化硅薄膜上制备固态纳米孔。由于聚焦离子束工作站本身的束径以及能量限制，直接制备纳米孔只能得到最小孔径30 nm的纳米孔，而无法一步制备小于30 nm的孔。同时研究了非聚焦离子束扫描纳米孔周围材料的缩孔效应，通过这个方法可以得到更小的纳米孔，但是非常耗时，不利于快速、大规模纳米孔的制备。随后使用高能透射电子显微镜在20 nm厚的氮化硅薄膜上制备出5 nm的孔。但是由于透射电子显微镜样品台的限制，每次只能加载一个样品，制备一个纳米孔，换样品繁琐，抽真空时间长，更加耗时且成本高。本课题研究致力于寻找一种快速、有效的纳米孔制备方法。基于氦离子显微镜的加工方法可以一次放入整个四寸晶圆到样品腔室内，省去不断更换样品的麻烦，而且可以一步刻蚀5 nm-100 nm任意孔径的纳米孔，无需沉积缩孔而制备小孔。氦离子显微镜技术克服了聚焦离子束工作站和透射电子显微镜的缺点，成为目前最有潜力的固态纳米孔制备技术。 本课题研究了在固态纳米孔表面制备一对纳米电极的结构的技术，采用半导体加工中的电子束蒸镀技术，在氮化硅薄膜表面先制备一条微米级的金属线，然后通过聚焦离子束将金属线刻蚀成宽度小于100 nm的纳米金属线，最后将纳米金属线与氮化硅薄膜同时刻蚀穿，就形成了集成纳米电极的纳米孔。但是由于聚焦离子束加工技术的限制，目前制备的纳米电极间距仍然比较大，而且纳米电极距离纳米孔孔口也有一定的距离，无法形成预期想要检测的横向电流，需要付出更多努力研究间距与检测生物分子非常接近的纳米电极以及纳米孔。 2λ-DNA易位行为的首次通过时间分析 将氦离子显微镜技术制备的纳米孔用于λ-DNA易位行为的检测实验。首先在实验中表征氦离子显微镜技术制备固态纳米孔的特征。实验发现，氦离子显微镜制备的纳米孔为圆柱形纳米孔，并且纳米孔孔口周围比较平滑，与透射电子显微镜制备的纳米孔相比较，在溶液中具有更低的噪声。在λ-DNA易位的实验中观测到λ-DNA以各种构象易位，符合理论推测。λ-DNA在溶液中的构象将会发生0次、1次、2次或者3次折叠，不同的折叠将会导致不同的易位行为从而产生不同的易位事件信号。将λ-DNA易位简化成最简单的一维偏布朗运动模型，检验首次通过时间概率密度方程解的形式。提取λ-DNA易位的直链即非折叠易位事件，分析不同电压下其阻塞电流值符合欧姆定律，用首次通过时间概率密度方程解的形式，即逆高斯分布拟合其易位时间分布，得到正确的不同电压下λ-DNA易位时间分布以及易位速度与电压的线性关系。根据拟合参数，计算了在纳米孔中λ-DNA链的电泳迁移率与扩算常数，与其他技术测得的已有数据进行对比。 利用λ-DNA链不同电压下的易位数据分析其易位事件的频率，以及穿过不同孔径的λ-DNA链易位的时间和电流阻塞值分析。 3 fd病毒颗粒易位的Stotz-Wien效应 用氦离子显微镜制备的固态纳米孔进行fd病毒颗粒易位行为研究。在实验中发现，fd病毒颗粒易位行为主要分为四种类型，其中类型Ⅰ是fd病毒颗粒从头到尾直接穿过固态纳米孔的易位行为，类型Ⅱ是fd病毒颗粒在穿过固态纳米孔之前，在水平表面纳米孔孔口附近与其相互作用一段时间之后，被电场力驱动进入纳米孔之后易位，类型Ⅲ是fd病毒颗粒一部分进入纳米孔，但是没有完全穿出，被困于纳米孔其中，经过一段时间的挣扎后，彻底完全穿过纳米孔，类型Ⅳ是fd病毒颗粒进入纳米孔之后迅速被电渗流反向推出纳米孔，而没有发生易位。提取所有电压下fd病毒颗粒类型Ⅰ和类型Ⅱ的易位事件，分析其阻塞电流值和易位时间，最后得到其易位速度与电场成非线性关系，这个关系符合Stotz-Wien效应。同时分析了不同浓度中、不同孔径下fd病毒易位的行为。为后续fd病毒的深入研究奠定基础。 综上所述，纳米孔单分子检测技术具有非常诱人的应用前景，需要大量的科学家付出更多的努力去研究该技术的发展。而且随着研究的深入，有理由坚信，基于纳米孔的单分子检测技术会成功。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 引言

1．1．2 生物单分子检测技术

1．2 纳米孔技术的产生与发展

1．2．1 纳米孔检测的基本原理

1．2．2 生物纳米孔技术的发展

1．2．3 固态纳米孔技术的发展

1．2．4 横向电流检测

1．2．5 石墨烯纳米孔的发展

1．3 纳米孔的修饰研究进展及应用现状

1．4 本课题的研究目标、内容、方法和技术路线

1．4．1 研究目标

1．4．2 研究内容

1．4．3 研究方法和技术路线

第二章 固态纳米孔的制备

2．1 引言

2．2 氮化硅薄膜的制备

2．3 聚焦离子束制备纳米孔

2．3．1 离子束与表面相互作用

2．3．2 钻孔

2．3．3 沉积

2．4 聚焦离子束制备纳米电极

2．5 透射电子显微镜制备纳米孔

2．6 氦离子显微镜制备纳米孔

2．6．1 氦离子显微镜作用原理

2．6．1 薄膜的制备

2．6．3 HIM制备纳米孔

2．7 本章小结

第三章 DNA易位首次通过时间分析

3．1 引言

3．2 一维基本扩散模型：首次通过时间分布

3．3 λ-DNA穿过纳米孔实验

3．3．1 实验原理

3．3．2 实验材料

3．3．3 实验流程

3．4 HIM制备纳米孔特性研究

3．5 离子电流轨迹分析

3．6 首次通过时间分析

3．6．1 λ-DNA易位行为特征分析

3．6．2 λ-DNA易位事件频率分析

3．6．3 λ-DNA易位阻塞电流分析

3．6．4 λ-DNA易位时间分析

3．6．5 DNA穿过不同孔径的纳米孔

3．7 结果与讨论

3．8 本章小结

第四章 固态纳米孔检测fd病毒

4．1 引言

4．2 fd病毒颗粒易位实验

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验步骤

4．3 fd病毒颗粒易位分析

4．3．1 fd病毒颗粒易位事件分类计数

4．3．2 类型Ⅱ的fd易位特征

4．3．3 类型Ⅰ和类型Ⅱ易位的模型

4．3．4 电场驱动fd病毒易位遵循欧姆定律

4．3．5 fd病毒颗粒鼻位中的Stotz-Wien效应

4．3．6 fd病毒穿过不同孔径的纳米孔

4．4 结果与讨论

4．5 本章小结

第五章 总结与展望

5．1 固态纳米孔的制备

5．2 首次通过时间分析λ-DNA易位

5．3 fd病毒颗粒易位分析

5．4 结论和课题意义

5．5 课题不足之处

5．6 课题展望

致谢

参考文献

作者简介

攻读博士学位期间主要研究成果