EGCG对慢性紫外线辐射光损伤的干预作用和不同剂型模型药物透皮分布的实验研究

摘要

研究背景日光中的紫外线(UV)，主要为长波紫外线(UVA)和中波紫外线(UVB)，UVA主要作用于真皮，其深度可达真皮中部，成纤维细胞是其作用的主要靶部位，UVA辐射主要引起氧化应激，诱发产生活性氧类物质(Reactiveoxygenspecies，ROS)。UVB部分可达真皮浅层，成纤维细胞是其靶部位之一，UVB辐射可引起活性氧类物质的产生、局部和系统性的免疫抑制，但最主要是被皮肤细胞DNA吸收而直接引起DNA损伤。 绿茶提取物茶多酚中的主要活性成分没食子儿茶素没食子酸脂(epigallocatechingallate，EGCG)有着广泛的生物学效应，如抗过氧化及抗肿瘤等作用。 UV单次辐射引起的急性光损伤，往往引起细胞增殖减慢、凋亡增加，光加合物嘧啶二聚体形成，急性大剂量照射甚至可以导致DNA突变及皮肤癌发生。加入EGCG干预，可以减少急性光损伤所引起的细胞增殖减慢、凋亡增加，减少光加合物嘧啶二聚体形成，减轻损伤，下调p53等抑癌基因的表达。但对慢性UV辐射所导致的细胞增殖、突变、凋亡、老化，以及加入EGCG后的干预作用目前研究甚少。 可以MTT法研究UV辐射后的细胞增殖情况。可用克隆法来检测细胞HPRT基因位点突变频率，从而判断UV辐射或者干预因素对于细胞的致突变力。 可用流式细胞仪检测UV辐射后凋亡及细胞周期变化情况。细胞周期包括G0/G1、S和G2/M期，当受到外界损伤性刺激是，细胞DNA合成与分裂时间延长，细胞大量停滞在G0/G1、S和G2/M期，为修复DNA损伤赢得时间，创造条件。 UV辐射后的细胞老化情况有很多指标可以反映，其中衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-Gal)最具代表性且检测方便。在老化的细胞中，SA-β-Gal表达升高。近来研究显示机体内的细胞衰老也是一种重要的抗肿瘤防卫机制，衰老反应是一种避免细胞发生肿瘤转化的安全控制机制。 本研究所涉及的中药单体EGCG为一种水溶性物质，为了将其更好的运用于临床皮肤病的预防及治疗，开发研制一种合适的剂型是非常必要的。脂质体是由脂质双分子层组成的多层囊泡，有生物膜的特性和功能，本身可生物降解，无毒性，无皮肤刺激性，具有亲水性和疏水性，可以促进水溶性或难溶药物的经皮吸收。当前，载药脂质体在皮肤病治疗中的应用越来越受到重视。但其与传统剂型如溶液、乳剂的区别和优势并不是很清楚。荧光素钠(NaFl)具有荧光特性故可示踪并可通过荧光分光光度计予以定量，因其为一种可溶性物质，故我们将它选为水溶性药物的模型药物。 本项目旨在研究慢性UV辐射对培养状态下人皮肤成纤维细胞的HPRT基因位点突变频率、细胞凋亡率、细胞周期变化、细胞老化比率的影响以及加入EGCG后的干预作用和不同剂型模型药物的透皮分布情况，籍此可为天然防晒剂的开发和实际应用提供理论依据和实验数据参考。 目的观察长波和中波紫外线日常剂量慢性照射对培养状态下人皮肤成纤维细胞的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因位点突变频率、细胞凋亡率、细胞周期和细胞老化比率的影响以及EGCG的干预作用；观察以荧光素钠为水溶性药物的模型药物，在溶液、脂质体和乳剂(O/W)制剂状态下对人体皮肤透皮性能和在皮肤分布的影响，籍此可为天然防晒剂的开发和实际应用提供理论依据和实验数据参考。 方法1.细胞培养：分离获得新生儿包皮环切术后皮肤成纤维细胞，在37℃、5﹪CO2。条件下培养于含10﹪胎牛血清的DMEM培养基中，根据实验目的不同分别定量接种在6孔板以及100mm培养皿中备用。2.药物配置：以DMEM培养液配制EGCG，贮存液浓度500μg/ml，分装贮存于-20℃冰箱，EGCG的实验终浓度为25μg/ml。 3.实验分组：成纤维细胞培养48h后，分为6组进行实验，包括空白对照组、EGCG组、慢性UVB(290～320nm)辐射组、慢性UVB+EGCG组、慢性UVA(320～400nm)辐射组、慢性UVA+EGCG组。 4.紫外线照射：根据实验设计定时定量分别予UVA或UVB照射培养细胞并预先加入相关药物 5.HPRT基因位点突变频率检测：克隆法检测各组细胞HPRT基因位点突变频率。 6.细胞凋亡率及细胞周期检测：收集各组细胞，流式细胞仪检测成纤维细胞凋亡率及细胞周期改变。 7.细胞老化检测：SA-β-Gal组织化学染色法检测细胞老化。 8.NaFl模型药制备：以超声波法制备成0.125﹪NaFl脂质体混悬液(A剂型)，常规方法制备0.125﹪NaFl溶液(B剂型)和0.125﹪NaFl乳剂(C剂型)(O/W)。 9.透皮实验：用离体人皮进行水溶性模型药物三种剂型的体外透皮实验。 10.模型药物透皮分布的观察：荧光显微镜观察待测皮肤制成的组织病理切片，分析模型药物的分布情况。 11.模型药物累积透过量以及在皮肤各层贮留量的检测：用荧光分光光度计分别检测2h～12h接收池和表皮、真皮浅层、真皮深层中模型药物的荧光值，根据标准曲线计算模型药物贮留在接收池和皮肤各层的浓度。 结果1.日常剂量UV慢性辐射后可上调人皮肤成纤维细胞的HPRT基因位点突变频率，加入EGCG可显著下调HPRT基因位点突变频率。在未经照射的正常细胞中，自发突变率很低，慢性UVB及慢性UVA照射诱导的突变分别是未经照射的自发突变的72倍及241倍，而经EGCG处理的UVB+EGCG组和UVA+EGCG组突变频率显著低于单纯UVB和单纯UVA照射组，分别较单纯UVB组和单纯UVA组降低了52.78﹪和32.37﹪。 2.日常剂量UV慢性辐射后可上调人皮肤成纤维细胞的凋亡率，加入EGCG可进一步上调其凋亡率，使细胞大量停滞于G0/G1期和G2/M期。空白对照组及EGCG组均未见明显的凋亡峰。慢性UVA辐射组和慢性UVB辐射组较空白对照组细胞凋亡率分别增加了33倍和43.22倍，S期细胞增多，慢性UVB辐射组的细胞凋亡率较慢性UVA辐射组增加了30.06﹪；而经EGCG处理的UVB+EGCG组和UVA+EGCG组凋亡率则明显上升，两组分别与单纯UVB组和单纯UVA组比较细胞凋亡率分别增加了87.08﹪和56.92﹪，且G0/G1及G2/M期细胞增多，EGCG+慢性UVB照射组较其单纯照射组凋亡率增高幅度大于EGCG+慢性UVA照射组较其单纯照射组，其中P值均＜0.05，差异具有统计学意义。 3.EGCG可减缓生理代谢状态下的人皮肤成纤维细胞老化，在未经照光实验组中，正常细胞与EGCG共培养80天后，EGCG组的β-半乳糖苷酶阳性细胞数较空白对照组下降了47.60﹪(P＜0.05)，可见加入EGCG可在一定程度上减缓自然代谢过程的细胞老化。 日常剂量UV慢性辐射后可上调人皮肤成纤维细胞的老化概率，加入EGCG可进一步上调其老化概率。在受试细胞为经慢性UV干预实验中，培养16天的正常细胞组及与正常细胞共培养的EGCG组均只见少量的β-半乳糖苷酶阳性细胞。其余几组阳性细胞比率为：慢性UVB组＜慢性UVA组＜EGCG+慢性UVB组＜EGCG+慢性UVA组，4组细胞间阳性比率经单因素方差检验差异均有统计学意义(P＜0.05)。4.溶液剂型和脂质体剂型的模型药物累积透皮量相对较小，乳剂组的药物透皮量显著高于其他两组。脂质体剂型的模型药物始终浓集在表皮层，溶液剂型的模型药物基本只停留在角质层，只有12h后药物深至真皮层，乳剂的模型药物自表皮至真皮的浓度始终显著高于其他两种剂型。 结论慢性照射日常剂量UVA，其损伤性高于UVB。EGCG可以降低日常生理剂量UV慢性照射引起的HPRT基因位点突变频率，上调日常生理剂量UV慢性照射引起的细胞凋亡频率及老化概率，提示EGCG可能可以减少突变细胞，降低皮肤癌症的发生，这可能是通过诱导不可逆损伤细胞的老化及凋亡而达到的。为了促进EGCG的临床应用而设计的不同剂型模型药物透皮实验显示：皮肤外用制剂中脂质体包裹水溶性药物可在人皮肤表皮层保持较高浓度，真皮贮留量和累积透皮量小，故适用于病变存在于表皮的皮肤病以及那些透皮吸收后有副作用的药物。乳剂由于其表皮真皮药物分布量及皮肤透过量均较其他两种剂型高，故适用于有效浓度低及透皮吸收后副作用小的药物。溶液剂型适用于角质层剥脱的皮肤病以及透皮吸收后副作用小的药物。

目录

全文技术流程图(flow chart of techniques)

全文主要缩略语（Abbreviations）

引言

摘要

第一部分EGCG干预慢性UV辐射诱导人皮肤成纤维细胞光损伤的研究

第一节EGCG有效作用浓度的选择

第二节 EGCG干预UV诱导人皮肤成纤维细胞HPRT基因位点突变的研究

第三节 EGCG干预慢性UV辐射诱导人皮肤成纤维细胞凋亡的研究

第四节 EGCG干预慢性UV辐射诱导人皮肤成纤维细胞老化的研究

第二部分不同剂型模型药物透皮分布的研究

全文小结

参考文献

综述细胞衷老的抗肿瘤作用

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致谢

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