大容量天然人源Fab抗体库的构建及日本血吸虫抗独特型抗体的筛选、鉴定

摘要

血吸虫病是一种严重危害人民身体健康的人畜共患寄生虫病。以往的研究证明，以化疗为主的血吸虫病防治策略难以达到阻断传播的目的。因此，疫苗成为血吸虫病防治一项优先发展的策略。血吸虫本身有多个发育期，抗原成分复杂多样，且日本血吸虫80﹪的保护性抗原为多糖或糖蛋白性质，这些糖类抗原表位在血吸虫保护性免疫及其调节方面起着重要作用，但难以用基因工程方法制备。根据Jerne的免疫网络学说，抗独特型抗体(anti-id)可通过其可变区中的独特型表位模拟抗原，诱导出与抗原相似的免疫应答。管晓虹等根据此学说制备了一株日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30，主动免疫小鼠、山羊，具有较好的抗感染免疫和抗病免疫功效。但由于NP30为鼠源性抗体，作为异种蛋白用于人体可产生人抗小鼠抗体(humananti-mouseantibody，HAMA)，从而限制了它在人体的应用。本文应用噬菌体抗体库技术，构建大容量天然人源Fab抗体库，从中富集、筛选全人源日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定，为研制可用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定基础。 材料与方法1.取15位健康成人骨髓经分离后的淋巴细胞，提取总RNA，逆转录成cDNA。用一组人特异性引物将VH、VLκ、VLλ基因扩增出来，从质粒pComb3XTT和pComb3XSS中将CH1、CLκ和CLλ分别扩增出来。再通过重叠PCR得到Fab基因片断，然后将Fab片断电导入pComb3XTT中，加入培养基、抗生素、辅助噬菌体VCSM13过夜后，PEG8000沉淀得到天然人源Fab噬菌体抗体库。 2.以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫BALB/c小鼠，使用ProteinGHP纯化鼠血清得到IgG，分别以正常鼠血清IgG和免疫鼠血清IgG包板，将建立的抗体库依次孵育后进行六轮洗脱、富集，从第六轮筛选后得到的细菌集落中随机挑选80个克隆，用ELISA鉴定，将阳性克隆进行可溶性表达。 研究结果1.用四对κ链基因引物、九对λ链基因引物和六对重链基因引物扩得Fab基因片断，经过一百次电转化将其导入E.coliXLI-Blue菌中，构建了库容为2×109的全人源Fab噬菌体抗体库。 2.以纯化鼠血清IgG为抗原进行了六轮富集筛选，从全人源Fab噬菌体抗体库中筛选出抗独特型噬菌体抗体并进行富集。每一轮筛选后，噬菌体抗体收获率均有增加，第六轮筛选的噬菌体抗体收获率较第一轮提高了1.4×104倍。 3.经ELISA鉴定出四株(C12、C19、D1、D2)抗独特型抗体。IPTG诱导表达其中一株(C12)表达可溶性抗体。经SDS-PAGE电泳，在相对分子量50KD和25KD处出现两条较明显的表达带，为Fab-Histag融合蛋白。 研究结论1.成功构建了大容量天然人源Fab抗体库，为今后制备针对各种抗原的全人抗体提供了一个技术平台。 2.从上述库中筛选获得四株日本血吸虫抗独特型抗体，对其中一株(C12)进行了可溶性表达，并经SDS-PAGE电泳初步鉴定，为制备可用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗候选分子奠定了基础。

目录

中英文对照

前言

第一部分全人源Fab噬菌体抗体库的构建

第二部分日本血吸虫抗独特型噬菌体抗体的筛选、鉴定

参考文献

综述：噬菌体抗体库筛选技术

致谢

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