β微管蛋白调节新核浆蛋白TBC1D3细胞内定位和EGFR信号转导

摘要

目的:
　　TBC1D3又称PRC17（前列腺癌基因17），是人科动物特有的癌基因，在多种肿瘤细胞中高表达，TBC1D3蛋白能延迟EGFR的降解，激活Ras及Erk1/2和Akt，促进细胞的增殖及恶性转化。寻找并鉴定新的与TBC1D3相互作用的蛋白以及研究它们之间相互作用的生物学意义，将有助于阐明TBC1D3的功能和其在肿瘤发生中的作用机制，为肿瘤的诊断和防治提供新线索。作者所在实验室研究人员前期通过GST pull-down结合质谱分析，对TBC1D3的相互作用蛋白进行筛选，初步鉴定β微管蛋白可能是TBC1D3的相互作用蛋白。然而，它们在细胞内的相互作用需要进一步通过实验来证实，并且α微管蛋白与β微管蛋白一起形成的二聚体是微管的基本结构单位，TBC1D3是否与α微管蛋白及微管也存在联系，它们的相互作用是否影响TBC1D3调节EGFR稳定性及信号转导，需要进一步研究阐明。
　　方法:
　　为了鉴定TBC1D3与β微管蛋白在细胞内的相互作用，以HA载体为对照，将HA-TBC1D3转染SMMC-7721细胞中进行表达，然后，用抗HA抗体和抗β微管蛋白抗体分别进行免疫共沉淀，检测TBC1D3与β微管蛋白在细胞内的相互作用;用同样方法检测TBC1D3与α微管蛋白在细胞内的相互作用;以BSA为阴性对照，以MAP2为阳性对照，用微管结合（沉淀）实验检测TBC1D3癌蛋白与微管的相互作用;将EGFP-TBC1D3转染SMMC-7721细胞后，用抗β微管蛋白抗体进行免疫荧光染色，观察TBC1D3癌蛋白与β微管蛋白在细胞内的分布及共定位，以进一步验证TBC1D3与β微管蛋白及微管在细胞内的相互作用。
　　为了分析TBC1D3上与β微管蛋白结合的功能部位，用标准PCR技术等构建一系列TBC1D3羧基端巢式缺失突变体，用over-lapPCR构建TBC1D3多种内在缺失突变体。以HA为对照，分别将HA-TBC1D3和其突变体转染SMMC-7721细胞，用免疫共沉淀技术检测它们与β徼管蛋白的相互作用，以分析确定TBC1D3氨基酸序列中与β微管蛋白相互作用的功能部位。
　　为了分析TBC1D3与β微管蛋白及微管相互作用对TBC1D3在细胞内分布的影响，构建一系列与EGFP融合表达的TBC1D3缺失突变体表达载体，这些表达载体分别被转染到S瑚C-7721细胞中表达，用共聚焦显微镜观察各突变体在细胞内的分布。同时，用微管解聚药物nocodazole处理细胞将微管破坏后观察TBC1D3在细胞内的分布变化。
　　TBC1D3与β微管蛋白的相互作用可能调节TBC1D3或微管的功能。为了分析两者相互作用对EGFR稳定性、EGFR下游信号激活和细胞增殖的影响，分别用HA-TBC1D3和β微管蛋白结合缺陷的TBC1D3突变体转染SMMC-7721细胞，经血清饥饿和随后一定时间的EGF刺激，用蛋白质印迹法检测细胞内EGFR及磷酸化Erk1/2的水平，用CCK8方法检测细胞存活状况。
　　TBC1D3癌蛋白与β微管蛋白/微管相互作用调节EGFR信号转导的两个可能机制，一是TBC1D3与微管结合并抑制其乙酰化，使EGFR难以运输到溶酶体内降解。为了探讨此种可能的机制，以HA为对照，将HA-TBC1D3转染SMMC-7721细胞，用抗乙酰化微管抗体进行蛋白质印迹，检测微管的乙酰化状态;二是微管与TBC1D3结合并介导其对c-Cbl募集和EGFR泛素化的抑制作用，使EGFR难以泛素化而不能降解。为了探讨此种可能的假设，以HA为对照，将HA-TBC1D3和其不能与β微管蛋白结合的突变体分别转染SMMC-7721细胞，然后，用抗EGFR抗体进行免疫共沉淀，用抗c-Cbl抗体和抗泛素抗体分别检测沉淀物中c-Cbl含量和泛素化修饰的EGFR。
　　结果:
　　用抗HA抗体进行免疫共沉淀，可检测到与HA-TBC1D3而不是HA对照相互作用的β微管蛋白;以同种属IgG为阴性对照，用抗β微管蛋白抗体进行免疫共沉淀，可检测到与β微管蛋白相互作用的TBC1D3蛋白。这些结果验证了TBC1D3与β微管蛋白在细胞内的相互作用。同样，免疫共沉淀实验也检测到TBC1D3与α微管蛋白在细胞内的相互作用。微管结合分析实验显示，TBC1D3同阳性对照MAP2一样与微管结合，而阴性对照BSA并不与微管结合，提示微管可能通过其组成成分α和β微管蛋白二聚体或寡聚体介导与TBC1D3癌蛋白相互作用。通过免疫荧光染色观察到TBC1D3与β微管蛋白在细胞质及细胞膜上均有共定位分布，细胞质里共定位分布于管泡状或点状结构;用HA-TBC1D3及其一系列羧基端巢式或内在缺失变异体进行免疫共沉淀实验，结果提示TBC1D3蛋白序列上与β微管蛋白相互作用的部位可能在286到353位氨基酸之间。
　　免疫荧光染色后用激光扫描共聚焦显微镜进行观察，显示β微管蛋白结合缺陷的TBC1D3突变体虽然仍存在于细胞质膜上，但已从细胞浆完全消失，而出现于细胞核;用微管解聚药nocodazole破坏微管，也能使TBC1D3出现相同的细胞质核转位，表明TBC1D3是一个未见报道的核浆蛋白，其在细胞内的分布受到微管与TBC1D3相互作用的调节。
　　TBC1D3能抑制EGFR对其E3泛素连接酶c-Cbl的募集，使EGFR难以泛素化和降解，从而出现下调障碍，导致EGFR信号途径的下游分子Erk1/2异常活化，促进细胞异常增殖;相反，β微管蛋白结合缺陷使TBC1D3突变体丧失了抑制EGFR募集c-Cbl的功能，使EGFR能被c-Cbl泛素化和在溶酶体内降解，从而该TBC1D3突变体既不能增强和延长Erk1/2活性，又不能促进细胞增殖，提示β微管蛋白和微管参与TBC1D3对EGFR稳定性和信号转导的调节。
　　结论:
　　1.TBC1D3与β微管蛋白在肝癌细胞内能相互作用，其相互作用部位可能位于TBC1D3蛋白第286到353位氨基酸之间;
　　2.TBC1D3癌蛋白是细胞内一种未见报道的核浆蛋白（neucleocytoplasmic protein），其空间定位受β-微管蛋白及微管调节;
　　3.TBC1D3增强肝癌细胞内EGFR信号转导依赖于其与β-微管蛋白及微管相互作用，表明微管具有一种未见报道的调节EGFR降解和信号转导的机制;
　　4.TBC1D3抑制c-Cbl募集和EGFR泛素化的部位可能在细胞浆内，而不是在细胞质膜上。

目录

声明

摘要

英文缩略词

前言

第一章 文献综述 癌蛋白TBC1D3的研究进展

1．TBC1D3与EGFR信号通路

2 其它

3 展望

第二章 癌蛋白TBC1D3与β微管蛋白、α微管蛋白及微管相互作用的鉴定

前言

1．实验材料

2．实验方法

3．结果

4．讨论

第三章 癌蛋白TBC1D3与β微管蛋白相互作用部位的鉴定

1．实验材料

2．实验方法

3．结果

4．讨论

第四章 TBC1D3癌蛋白与β微管蛋白／微管相互作用调节肝癌细胞内EGFR信号转导

1．实验材料

2．实验方法

3．结果

4．讨论

结论

参考文献

作者简介

致谢