大鼠糖皮质激素受体基因腺病毒载体的构建及其在肾系膜细胞中的表达

摘要

目的：利用AdEasy系统构建大鼠糖皮质激素受体(GR)基因重组腺病毒载体，转染大鼠系膜细胞，并通过Western Blot方法检测GR蛋白的表达． 方法：将质粒pcDNA1．Neo-Rat GR扩增、胶回收获得的Rat GR cDNA双酶切片段插入腺病毒穿梭载体质粒pShuttle-CMV的巨细胞病毒(cMV)启动子下游，构建重组穿梭载体pShuttle-CMV-Rat GR，线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内经同源重组得到腺病毒重组质粒pAd-Rat GR，经人胚肾293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒Ad-Rat GR；用包装后的病毒上清转染大鼠肾系膜细胞，提取细胞中的总蛋白，通过Western Blot方法检测GR蛋白的表达。 结果：连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAd-Rat GR重组质粒，；经人胚肾293细胞包装，48小时后观察到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)明显表达，氯化铯梯度离心纯化最终获得1×10<'9>PFU/ml滴度的重组病毒；用该滴度的Ad-Rat GR，转染大鼠肾系膜细胞48h后，提取细胞总蛋白，Western Blot检测，GR蛋白有明显表达． 结论：构建的大鼠糖皮质激素受体(GR)基因腺病毒载体能够在大鼠肾系膜细胞(Msc)中表达GR蛋白，并有上调作用。

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综述