PKMzeta-MAPK通路介导SSRI抗抑郁剂氟西汀调节海马神经干细胞再生

摘要

研究背景:抑郁症是一种严重损害人类健康的高发精神疾病，其发病机制至今不明，存在诸多假说，其中“抑郁症海马神经再生障碍”假说受到广泛关注。选择性5-羟色胺再吸收抑制剂(SSRI)可逆转抑郁症海马神经再生障碍并发挥其治疗效应，其作用机制可能与5羟色胺(5-HT)激动突触后膜5-HT1A受体，进而上调丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路有关。我们近期临床研究发现MAPK通路上游PRKCZ基因存在与抗抑郁疗效相关的多态性位点，PRKCZ基因在海马特异性编码一种非典型PKC激酶（PKMζ蛋白）。因此，探索PKMζ是否可能通过磷酸化激活MAPK通路并介入应激因素和SSRI类抗抑郁剂氟西汀对神经干细胞再生的调节机制，为进一步探讨抑郁症的病因及寻找抗抑郁治疗新策略有重要的意义。
　　目的:(1)探讨PKMζ是否介导SSRI促进海马神经再生作用。(2)探讨PKMζ依赖的细胞内信号通路的调控机制。
　　方法:(1)体外培养Sprague Dawley(SD)大鼠胎鼠海马神经干细胞(NSCs)，通过实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和免疫印迹(Western-blotting)检测NSCs中三种非典型PKC(PKCζ、PKCι和PKMζ)的表达，并利用GFP慢病毒包装的PKMζ特异性siRNA载体，构建PKMζ低表达的NSCs。(2)以细胞免疫荧光观察NSCs5羟色胺（5-HT）、5-HT1A受体（5-HT1AR）、5-HT转运体(SERT)以及色氨酸羟化酶(TPH)的表达，ELISA检测氟西汀对增殖期和分化期NCS细胞培养液内5-HT水平的影响。(3)以细胞免疫荧光检测NSCs再生（增殖、分化和凋亡），结合Real-time PCR和Western-blotting，探讨PKMζ-MAPK-CREB通路是否参与氟西汀神经再生调节。(4) SD大鼠双侧腹侧海马齿状回（DG区）脑立体定位注射PKMζsiRNA，采用糖水偏好试验、强迫游泳试验和旷场试验观察大鼠行为学改变。通过Real-time PCR检测大鼠腹侧海马PKMζ基因的表达。
　　结果:(1)大鼠海马神经干细胞表达PKCι和PKMζ，而不表达PKCζ。氟西汀显著增加正常培养和应激状态下PKMζ蛋白表达水平，不影响PKCι蛋白表达水平。(2) siRNA干扰敲减PKMζ效率＞80％并显著降低海马神经再生。在正常和应激状态下，PKMζ低表达的NSCs中，氟西汀不能充分发挥神经再生的调节作用。(3)胎鼠海马神经干细胞表达5-HT1A受体，五羟色胺转运体(SERT)，色氨酸羟化酶(TPH)和5-HT，并且氟西汀可以显著增加体外培养胎鼠海马神经干细胞的细胞外5-HT水平。氟西汀和5-HT1AR激动剂8-OH DPAT上调PKMζ表达，5-HT1AR拮抗剂WAY-100635下调PKMζ表达，并可阻断氟西汀和8-OH DPAT的上调效应。(4)氟西汀和8-OH DPAT显著增加ERK1/2和CREB蛋白的磷酸化水平，此效应可以被WAY-100635阻断。PKMζ阻断剂ZIP和选择性MAPK拮抗剂U0126可以显著抑制氟西汀和8-OH DPAT对MAPK-CREB通路磷酸化的上调作用。(5)氟西汀和8-OH DPAT均能促进NSC神经再生，此效应可以被WAY-100635阻断。ZIP和U0126可以显著抑制氟西汀和8-OH DPAT对海马神经干细胞再生的促进作用。(6) PKMζ siRNA慢病毒注射后7天，大鼠糖水偏爱率有下降趋势，强迫游泳不动时间显著增加，而PKMζmRNA表达无明显改变。
　　结论:PKMζ是氟西汀调节海马神经再生的关键因子;氟西汀可能通过增加5-HT传递并强化突触后5-HT1AR调节PKMζ的水平;5-HT1AR激活下游PKMζ-MAPK通路是氟西汀促进海马神经再生效应的重要胞内信号转导机制。

目录

声明

摘要

中英文对照及部分缩略词

前言

文献综述 抑郁症海马神经再生障碍及其分子生物学机制

第一部分 PKMζ与氟西汀调节胎鼠海马神经干细胞再生关系的研究

实验材料和方法

实验结果

小结

第二部分 PKMζ介导氟西汀调节胎鼠海马神经干细胞再生机制的研究

实验材料和方法

实验结果

小结

第三部分 PKMζ与动物抑郁样行为学关系的研究

实验材料与方法

实验结果

小结

讨论

参考文献

结论

致谢

作者简介及攻读博士学位期间发表的论文