吡喹酮化疗对日本血吸虫慢性感染鼠机体免疫抑制状态的影响

摘要

血吸虫病(schistosomiasis)是一种世界分布的人兽共患寄生虫病，是所有寄生虫病中分布最广、危害最严重的疾病之一。人群流行病学和动物模型研究均提示，随着日本血吸虫感染的慢性化进程，宿主出现免疫下调现象。除了血吸虫病外，很多慢性感染性疾病，如利什曼病，结核病等，也存在免疫下调现象。近几年，一些研究者将这种持续慢性感染状态与CD4+CD25+T细胞诱导的免疫抑制作用联系起来。对曼氏血吸虫慢性感染的研究已经开始涉及CD4+CD25+T细胞的免疫调节作用，但迄今为止，在日本血吸虫感染的研究中却少有报道。基于日本血吸虫痴慢性期的免疫下调现象，本课题组前期实验结果提示，CD4+CD25+T细胞与日本血吸虫病慢性期的免疫下调现象有关，结合其它慢性感染性疾病的研究资料，设计本研究，进一步探讨日本血吸虫慢性感染小鼠在解除抗原持续刺激后，体内CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Tregs)功能和数量的变化以及对机体免疫应答状态的影响，并初步探讨其变化机制，为进一步研究CD4+CD25+Tregs在日本血吸虫感染慢性化过程中的免疫下调作用提供实验资料。 我们首先建立日本血吸虫慢性感染小鼠模型，在感染后13wk，给予吡喹酮化疗。在化疗后的不同时间点上，为了观察CD4+CD25+Tregs数量变化以及影响其变化因素，采用免疫组织化学方法检测肝脏肉芽肿内Foxp3+细胞的分布；以三色流式细胞术检测小鼠脾脏组织中CD4+CD25+Foxp3+T细胞相对比例的变化；运用实时荧光定量PCR方法检测Foxp3 mRNA在脾脏cD4+T细胞中的表达水平。为进一步观察吡喹酮化疗后CD4+cD25+Tregs抑制功能变化以及机体对非相关抗原OVA的免疫应答反应，运用免疫磁珠分离纯化脾脏CD4+CD25+T细胞，在有丝分裂原ConA(刀豆蛋白A)刺激下，采用同位素3H-TdR掺入细胞增殖实验分析CD4+CD25+T细胞对脾脏CD4+CD25-T细胞体外增殖的抑制作用；以OVA免疫吡喹酮化疗后14d的慢性感染期小鼠，用ELISA检测血清中抗OVA(卵清蛋白)抗体水平。 本研究获得如下主要结果： 1. 吡喹酮化疗对日本血吸虫慢性感染小鼠肝脏虫卵肉芽肿内Foxp3+细胞分布的影响免疫组织化学染色显示，正常小鼠肝脏中几乎没有Foxp3+细胞分布，而日本血吸虫感染慢性期，肝脏虫卵肉芽肿内分布大量的Foxp3+细胞。给予吡喹酮化疗后3d，虫卵肉芽肿内Foxp3+细胞无明显变化，到化疗后7d时，Foxp3+细胞明显变少，到14d时几乎见不到FoXp3+细胞。Foxp3蛋白是CD4+CD25+Tregs的主要标志分子。本观察结果提示，日本血吸虫慢性感染鼠经吡喹酮有效治疗后，肝脏虫卵肉芽肿内CD4+cD25+Iregs数量减少到正常水平。 2.吡喹酮化疗对日本血吸虫慢性感染小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量的影响流式细胞仪检测结果表明，脾脏cD4+cD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞比例在慢性感染期鼠为(15.37±0.38)％，在正常小鼠脾脏中其比例为(11.37±0.51)％，二者之间差异有显著性意义(P<0.01)。给予吡喹酮化疗后，感染鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞比例逐渐下降，其比例在化疗后3d为(14.37±0.64)％，7d时为(12.62±1.05)％，与慢性期比较差异有统计学意义(P<0.05)；到化疗后14d时为(11.47±0.46)％，已下降到正常水平。结果提示，日本血吸虫慢性感染鼠在有效病原治疗后，脾脏CD4+CD25+Tregs数量也逐渐降至正常水平。 3.吡喹酮化疗对小鼠脾脏CD4+T细胞Foxp3 mRNA表达水平的影响实时荧光定量PCR结果显示，在慢性感染期小鼠脾脏CD4+T细胞Foxp3 mRNA的相对表达水平为1.01±0.15，在正常小鼠中其相对表达水平为0.75±0.16，二者差异有统计学意义(P<0.05).给予吡喹酮化疗后，小鼠脾脏CD4+T细胞Foxp3 mRNA相对表达水平在第3d为0.70±0.18，与慢性期比较差异有统计学意义(P<0.05)，到化疗后7d和14d时，Foxp3 mRNA相对表达水平仍然保持在化疗后3d的水平上。结果提示，日本血吸虫慢性感染鼠在给予吡喹酮化疗后，CD4+CD25+Tregs的标志分子Foxp3在基因转录水平上的变化与CD4+CD25+Tregs数量上的变化相一致，并且在时相上先于数量变化。 4.影响脾脏cD4+cD25+Foxp3+T细胞数量变化相关因素的研究上述实验结果显示，日本血吸虫慢性感染期小鼠给予吡喹酮化疗后，脾脏CD4+CD25+Foxp3十T细胞数量及Foxp3基因表达下降。为排除吡喹酮对实验结果的影响，给予正常小鼠吡喹酮处理，分别在3d、7d和14d，流式细胞仪检测脾脏CD4+CD25+Foxp3+T占CD4+T的比例。结果显示，各组之间的比例变化差异无显著性意义(P>0.05)。为探讨CD4+CD25+Tregs的数量变化是否与病原治疗后血吸虫成虫被杀死并在短时间内释放大量抗原有关，将成虫可溶性抗原经腹腔注射到慢性感染小鼠体内，7d后流式细胞仪检测脾脏CD4+CD25+Foxp3+T占CD4+T的比例。结果显示，未处理和注射PBS的慢性感染小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+T占CD4+T的比例分别为15.2％和15.1％，注射成虫可溶性抗原能使日本血吸虫慢性感染小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T的比例(12.5％)明显降低。结果提示，成虫可溶性抗原刺激可能是导致日本血吸虫慢性感染鼠脾脏CD4+CD25+Tregs数量下降的因素。 5.吡喹酮化疗对CD4+CD25+T细胞免疫抑制功能的影响3H-TdR掺入法检测细胞增殖实验结果显示，与正常小鼠来源的CD4+CD25+T细胞比较(cpm值为4092.00±122.76),慢性期来源的CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25T细胞增殖(cpm值为2952.25±88.03)的抑制作用较强(P<0.01)；给予吡喹酮化疗后，抑制作用逐渐减弱，化疗后3d时(cpm值为2954.00±295.57)，抑制作用无明显变化，到化疗后7d时(cpm值为3620.20±237.87)，抑制作用明显下降(P<0.05)，而到化疗后14d时，其抑制作用已下降到正常水平(cpm值为4283.60517.89)。结果提示，日本血吸虫慢性感染鼠给予吡喹酮化疗后，脾脏CD4+CD25+Tregs受感染因素诱导增强的抑制功能可在较短时间恢复到正常水平。 6.吡喹酮化疗对日本血吸虫慢性感染小鼠接受其它抗原刺激免疫应答的影响吡喹酮化疗后14d，用日本血吸虫非相关抗原OVA免疫小鼠，4wk后ELISA法检测血清特异性抗体水平。结果显示，日本血吸虫慢性感染小鼠在给予吡喹酮化疗前后血清中抗OVA抗体IgG A450值分别是0.68±0.14和1.04±0.22；IgG1抗体亚类A450值分别是1.16±0.13和1.35±0.06；IgG2a抗体亚类A450值分别是0.68±0.12和1.12±0.17；IgG2a与IgG1比值分别是0.59和0.86。结果表明，在解除抗原持续刺激后，宿主对非特异性抗原的免疫应答也恢复到正常水平，尤其是在感染慢性期被明显抑制的Th1应答上升明显。 本试验采用日本血吸虫慢性感染鼠模型，研究吡喹酮化疗前后机体CD4+CD25+Tregs以及免疫应答状态的变化情况，发现慢性感染期鼠体内CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量增加，抑制功能增强，而化疗后其数量下降，功能也恢复到正常水平，并且宿主对非相关抗原免疫应答由低应答状态恢复到正常水平。进一步研究发现，化疗后CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量下降可能与成虫释放的抗原刺激有关。研究结果提示，CD4+CD25+Tregs可能是日本血吸虫慢性感染期维持免疫抑制状态的重要因素，并且，经吡喹酮有效病原治疗后，血吸虫感染机体的免疫抑制状态，能在较短时间内得到改善。

目录

声明

一、前 言

二、材料和方法

三、结 果

四、讨论

五、小 结

六、参考文献

七、附 录

八、致谢

综述 调节性T细胞与寄生虫感染