Kir6.2基因敲除对MPTP所致C57BL/6J鼠神经毒性的影响

摘要

ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassiuln channels,K-ATP通道)是一类耦联细胞代谢和电活动、以细胞内ATP/ADP水平为门控因素、非电压依赖性的特殊钾离子通道。脑内K-ATP通道的分子组成具有多样性。Kir6.2亚基表达于大多数神经元，胶质细胞与神经干细胞则表达Kir6.1构成的K-A1]P通道。K-ATP通道在与帕金森病(Parkinson’s disease，PD)相关的黑质、纹状体脑区高度表达，并参与调节多种与PD相关的神经递质如多巴胺(dopamine，DA)和谷氨酸(glutamate，Glu)的释放，从生理学角度提示K-ATP通道与PD的发生、发展相关。 本实验室前期研究显示，K-ATP通道开放剂在氟哌啶醇、6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)、鱼藤酮、1.甲基-4-苯基吡啶离子(1-methvl-4-phenylpyridinium，MPPP+)导致的多种PD动物模型中发挥神经保护作用，其机制包括抗兴奋性毒性、抗凋亡、抑制神经炎症和恢复线粒体功能等，提示K-ATP通道与PD的发生发展密切相关；近期国外学者的研究结果亦显示K-ATP通道可能参与1-甲基-4-苯基-1，2,3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2,3，6-tetrapynidine，MPP)对中脑DA能神经元的损伤。但是目前仍缺乏K-ATP通道参与PD病理生理学机制的直接证据，关于K-ATP通道开放剂对Kir6.2基因敲除PD模型小鼠是否具有神经保护作用仍未有研究。 在实验室前期系列研究工作的基础上，本文工作应用Kir6.2基因敲除小鼠，首先阐明Kir6.2构成的K-ATP通道与脑内神经递质传导的相关性，继而应用MPTP长期间断给药制备经典的PD小鼠模型，以及MPTP单次给药诱导急性神经毒性，并给予K-A1]P通道开放剂(K-ATP cllanIlel opener，KCO)进行药物干预，研究K-ATP通道在MPTP所致神经损伤中的作用及其对神经再生过程、胶质细胞功能的调节。研究结果为K-ATP通道参与PD病程的发生发展提供直接的支持证据，并提示开放表达于不同神经细胞上的K-ATP通道在神经损伤中发挥多靶点的保护作用，为PD的临床治疗学提供新的思路。 第一部分Kir6.2基因敲除对纹状体神经递质释放的影响 目的：阐明在高钾刺激时Kir6.2构成的K-ATP通道调节纹状体神经递质的释放，提供K-ATP通道参与脑内神经传导的直接证据。 方法：1)对3月龄雄性野生型(wildtype，WT)和基因敲除型(knockout，KO)小鼠进行立体定位手术，在其右侧纹状体埋置套管，手术后恢复7 d，进行微透析实验：正常透析液平衡100 min后，100mM高钾灌流100 min，再以正常透析液平衡140 min，其间连续收集每20 min的灌流液。2)应用高效液相色谱-电化学法测定单胺类神经递质(多巴胺、双羟苯乙酸、高香草酸及5-羟吲哚乙酸)的水平；应用高效液相色谱一荧光法测定灌流液中氨基酸类神经递质(天冬氨酸、谷氨酸、牛磺酸及γ-氨基丁酸)水平。 结果：基础状态下，WT与KO小鼠纹状体灌流液中单胺类神经递质及其代谢产物、氨基酸类神经递质水平无差异。高钾刺激：1)显著增加两种基因型小鼠多巴胺及氨基酸类神经递质(天冬氨酸、谷氨酸、牛磺酸及γ-.氨基丁酸)的释放，与WT小鼠相比较，KO小鼠神经递质释放的增加幅度显著降低；2)显著降低WT小鼠纹状体多巴胺代谢产物双羟苯乙酸的水平，但显著增加KO小鼠的双羟苯乙酸水平；3)同等程度地降低两种基因型小鼠另一种多巴胺代谢产物高香草酸与5-羟色胺代谢产物5-羟吲哚乙酸的水平。 结论：Kir6.2构成的K-ATP通道调节高钾诱导的纹状体神经递质释放。Kir6.2基因敲除降低多巴胺及氨基酸类神经递质释放对高钾的反应性。 第二部分Kir6.2基因敲除对MPTP诱导帕金森病小鼠模型的影响 目的：应用Kir6.2基因敲除小鼠研究、阐明K-ATP通道对MPTP诱导慢性PD模型的影响，获取K-ATP通道参与PD病理生理学机制的支持证据。 方法：应用MPTP皮下注射，继而丙磺舒腹腔注射(每次MPTP20 mg·kg-1，s.c.，丙磺舒250 mg·kg-1，i.p.，一周2次，总计10次)制备慢性PD小鼠模型。Ipt(10 mg·kg-1·day-1，p.o.)，Dia(10 mg·kg-1·day-1，p.o.)或Cro(150或300ug·kg-1·day-1，p.o.)在MPTP首次给药前1 h灌胃，连续给药6周。应用自主行为和爬竿实验观察行为学改变，应用免疫组织化学结合体视学计数、ImageJ软件分析黑质致密部(substantia nigra pars cornpacta，SNpc)DA能神经元及纹状体DA投射纤维的损伤，同时检测黑质(substantia nigra，SN)、纹状体星形胶质细胞活化以及室管膜下层(subyentricular zone，SVz)、颗粒细胞下层(subgranular zone，SGZ)神经再生情况；应用高效液相色谱法检测纹状体、海马脑区单胺类神经递质及其代谢产物的含量改变。 结果：1)基础状态下，与WT小鼠相比较，KO小鼠自主活动显著减少，爬竿时间显著延长。2)MPTP慢性给药后，WT小鼠出现与PD类似的病理变化与神经化学改变，表现为SNpc DA能神经元死亡，纹状体DA及其代谢产物含量显著降低，同时伴有SN、纹状体星形胶质细胞增殖，SVZ与SGZ区新生细胞数量减少。KO小鼠的SNpc DA能神经元及SVZ、SGZ区神经干细胞数量无减少，星形胶质细胞增殖较WT小鼠显著减轻；纹状体DA水平显著低于WT小鼠。3)开放K-A1]P通道发挥神经保护作用：Ipt(10 mg·kg-1·day-1)，Dia(10 mg·kg-1·day-1)或Cro(150或300 μg·kg-1·day-1)处理可以显著改善野生型PD模型小鼠DA能神经元缺失与神经干细胞数量减少，并抑制两种基因型小鼠星形胶质细胞增殖，但是未能增加两种基因型小鼠纹状体DA及其代谢产物的水平。 结论：本部分工作发现Kir6.2基因敲除鼠中MPTP长期给药导致SNpc DA能神经元丧失的作用消失，表明K-ATP通道参与PD的发生发展过程；KCOs促进WT PD模型鼠SNpc区DA神经元存活，抑制星形胶质细胞增殖、逆转MPTP抑制神经再生的作用，提示KCOs通过调制胶质细胞功能与神经再生过程发挥多靶点的神经保护作用。 第三部分Kir6.2基因敲除对MPTP所致C57BL/6J鼠急性神经毒性的影响 目的：应用Kir6.2基因敲除小鼠研究、阐明K-ATP通道对MPTP急性神经毒性的影响。 方法：应用MPTP皮下注射，继而丙磺舒腹腔注射(MPTP 20mg·kg-1，s.c.，丙磺舒250 mg·kg-1，i.p.)的单次给药模式。Ipt(10mg·kg-1·day-1，p.o.)，Dia(10 mg·kg-1，p.o.)或Cro(150或300μg·kg-1，p.o.)在MPTP给药前1 h灌胃，连续给药3 d，统计各组小鼠的死亡率，并应用自主行为和爬竿实验观察行为学改变，应用免疫组织化学与体视学计数研究黑质纹状体系统DA能神经元及其投射纤维损伤，SN、纹状体星形胶质细胞活化情况、SVZ、SGZ神经再生情况；应用高效液相色谱法检测纹状体单胺类神经递质及其代谢产物的含量改变. 结果：1)Kir6.2基因敲除显著增加小鼠对MPTP急性神经毒性的敏感性：给予MPTP后，WT与KO小鼠的死亡率分别为4.8％和11.1％，KO小鼠的死亡率为WT小鼠的2.3倍，其纹状体DA、DOPAC、HVA含量的降低较WT小鼠更为显著，并出现SNpc酪氨酸羟化酶(tyrosine hvdroxylase，TH)标记神经元减少、纹状体TH纤维密度降低，伴有SN与纹状体星形胶质细胞增殖，SVZ、SGZ神经再生抑制；而在WT小鼠，MPTP仅导致纹状体区域的DA、DOPAC、HVA水平降低与星形胶质细胞增殖，以及SGz神经干细胞数量减少。2)开放K-ATP发挥神经保护作用：在WT小鼠，Ipt(10 mg·kg-1·day-1)或Cr0(150或300μg·kg-1·day-1)显著抑制MPTP诱导的纹状体星形胶质细胞增殖；Ipt(10 mg·kg-1·day-1)，Dia(10 mg·kg-1·day-1，p.o.)或Cr0(300 ng·kg-1·day-1)均可逆转MPTP抑制SGZ神经再生的作用，使新生细胞数量恢复到正常水平。在KO小鼠，Ipt(10mg·kg-1·day-1)或Cro(300ug·kg-1·day-1)促进黑质TH神经元存活，抑制MPTP诱导的黑质、纹状体星形胶质细胞增殖，逆转MPTP对SVZ、SGz神经再生的抑制作用。但是，开放K-ATP通道对MPTP降低两种基因型小鼠纹状体DA及其代谢产物含量的作用无影响。 结论：本部分工作发现Kir6.2基因敲除加重MPTP单次给药诱导的神经毒性，表明K-ATP通道调节MPTP的急性神经毒性作用；KCOs能够逆转MPTP对两种基因型小鼠的急性神经损伤作用，进一步佐证了KCOs的神经保护作用。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

前 言

第一部分Kir6.2基因敲除对纹状体神经递质释放的影响

引 言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

第二部分Kir6.2基因敲除对MPTP制备慢性帕金森病小鼠模型的影响

引 言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

第三部分Kir6.2基因敲除对MPTP所致C57BL/6J鼠急性神经毒性的影响

引 言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

结 语

参考文献

附 录：在读期间发表的与本论文相关的文章

综 述：ATP敏感性钾通道与帕金森病

致 谢