eha基因对迟缓爱德华菌及其在巨噬细胞内存活的影响

摘要

迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda，简称Et)是一种重要的人兽共患病原菌，能够在巨噬细胞内生存和繁殖，是其致病的关键。Et溶血调控基因(Et haemolysin activator gene，简称eha)是一个重要的转录调控基因，能够调控Et的某些毒力因子。已有研究表明，eha基因可能与Et的胞内生存有关，但是该基因如何影响该菌的胞内生存机制及其毒力尚未阐明。
　　WST-8和LDH细胞毒性检测结果均表明，野生株的细胞毒性明显高于eha缺失株，在电镜和倒置光学显微镜下也观察到这一现象。eha缺失株在SDS和多粘菌素B胁迫环境中的存活率明显降低，表明eha基因的缺失可能影响Et菌体相关成分的合成。RT-PCR结果表明，野生株中外膜蛋白基因pagC的转录水平高于eha缺失株;qRT-PCR结果显示eha缺失株中pagC的转录水平为野生株的0.45倍。SDS-PAGE电泳也显示，野生株的三种外膜蛋白表达水平高于eha缺失株，其中37kD外膜蛋白是诱导体液和细胞免疫保护抗体的重要抗原。因此，eha基因通过影响Et菌体相关成分的合成，影响Et菌在胁迫环境中的存活率。流式凋亡检测和电镜观察结果显示，eha缺失株感染细胞组的细胞凋亡率高于野生株感染细胞组，提示eha基因可抑制Et引起巨噬细胞凋亡的作用。RT-PCR结果显示，eha基因上调Et中Ⅲ型分泌系统分泌蛋白C和鞭毛蛋白C的表达，而Ⅲ型分泌系统可抑制宿主细胞的凋亡。但是eha基因是否通过调控Ⅲ型分泌系统的表达而影响Et对巨噬细胞的凋亡作用，还有待探讨。
　　通过Et感染RAW264.7细胞，菌落计数法测定其胞内存活及电镜、光镜观察结果表明，野生株和eha缺失株均可在巨噬细胞内存活和繁殖，但和野生株相比，eha缺失株在巨噬细胞内的繁殖速率明显下降。模拟巨噬细胞内强氧化环境的应激实验结果表明，相比野生株，eha缺失株对过氧化氢的敏感性显著提高，在过氧化氢中的存活率明显降低。流式检测细菌感染后巨噬细胞产生活性氧的水平，结果显示，eha缺失株感染细胞组(65.49％)高于野生株组(55.32％)。进一步用RT-PCR和qRT-PCR实验结果表明，eha基因的缺失下调了Et中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的转录水平;eha缺失株中sodC和katG的转录水平分别为野生株的0.1倍和0.42倍。这提示eha基因通过调控Et中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的表达，从而影响其分解巨噬细胞中活性氧的能力和在不同浓度过氧化氢中的存活率。
　　模拟巨噬细胞吞噬溶酶体中酸性环境的应激实验结果表明，pH5.0的酸处理细菌2h后，eha缺失株的存活率明显低于野生株。用ATPase抑制剂洛霉素A1抑制巨噬细胞的酸化，野生株和eha缺失株的胞内存活能力均有显著升高，但升高程度有明显差异。通过荧光显微镜观察吖啶橙(AO)染色的细胞颜色，结果显示，野生株和eha缺失株分别感染巨噬细胞引起细胞酸化的程度有差异，说明eha基因在调控Et抵御巨噬细胞酸化中起了重要作用。进一步用RT-PCR和qRT-PCR实验结果显示，相比野生株，eha缺失株中Ⅲ型分泌系统的分泌蛋白和谷氨酸脱羧酶的转录水平明显降低;eha缺失株中eseC和gadB的转录水平分别为野生株的0.07倍和0.68倍。这提示eha基因可能通过调控Et中Ⅲ型分泌系统和谷氨酸脱羧酶的表达，在抵御巨噬细胞酸化中起了重要作用。
　　进一步比较野生株和eha缺失株在小鼠肝脏、脾脏和肾脏中细菌CFU/organ的差异，发现eha缺失株的CFU/organ显著低于野生株，表明eha缺失株在宿主体内的生存能力明显降低。比较分析eha缺失株和野生株对小鼠LD50的差异，结果显示，eha缺失株相比野生株毒力下降了2.5倍。为比较这两个菌株对宿主损伤的差异，对分别感染这两个菌株的小鼠肝脏、脾脏和肾脏的病理变化进行了分析。结果显示，小鼠感染野生株1d后，出现肝细胞水肿和中性粒细胞浸润，脾小体内细胞坏死，肾小管水肿等病变，提示野生株对小鼠的肝脏、脾脏和肾脏有一定的毒性作用，而eha缺失株对上述脏器无明显毒性作用。这说明eha基因缺失后，Et的毒力明显减弱，对宿主的病理损伤减轻。可见eha基因影响Et在巨噬细胞内和宿主体内的存活及其毒力。
　　以上研究结果表明，eha基因能够通过上调Et某些毒力因子的表达，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、Ⅲ型分泌系统、谷氨酸脱羧酶和外膜蛋白等，来抵御巨噬细胞内活性氧、酸和抗菌肽等的杀（抑）菌作用，并抑制细胞的凋亡功能，有利于Et在巨噬细胞内和小鼠体内的存活和繁殖，增强细菌的毒力。通过本课题的研究，明确了eha基因是一个重要的毒力转录调控基因，对其调控Et胞内生存的分子机制有了一个初步的了解，为深入研究该菌复杂的致病机制和网络调控系统提供了重要线索。

目录

声明

摘要

符号、变量、缩略词等本论文专用术语的注释表

前言

文献综述 迟缓爱德华菌的研究进展

第一章 eha基因对迟缓爱德华菌毒性等方面的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二章 eha基因影响迟缓爱德华菌的胞内生存及其机制

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 eha基因影响迟缓爱德华菌在小鼠体内生存及毒力

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

作者简介

致谢