DNA芯片特异性杂交探针及其应用研究

摘要

DNA芯片作为一种高通量检测平台在基因表达、基因分型、突变筛选等领域的实验中得到了大规模应用。影响DNA芯片分析质量的主要因素之一就是DNA芯片的杂交特异性，完全匹配和单碱基错配序列结构在双螺旋稳定性上的微小的差异也可能限制这种技术的可靠性和广泛应用性。DNA探针是影响杂交特异性的主要因素之一，本文提出了一种新型的含次黄嘌呤碱基的寡核苷酸探针，旨在提高DNA芯片的杂交特异性，为提高DNA芯片分析准确性的探针优化设计提供一种新的可能的调变手段。本研究主要内容包括：
　　⑴含次黄嘌呤碱基探针的性能研究。通过比较在传统自然碱基寡核苷酸序列中位置引入不同数量次黄嘌呤碱基探针的杂交效果，发现在探针中引入4个次黄嘌呤碱基，即在SNP位点两端间隔两个自然碱基位置分别引入连续2个次黄嘌呤碱基时杂交效果最好;然后，比较了含次黄嘌呤碱基探针与传统探针的杂交特异性和灵敏度。采用含次黄嘌呤碱基的新探针，杂交后只要通过简单的清洗，就能有效区分正配序列和单碱基错配序列，正配序列的荧光强度是错配序列的5倍以上，而传统探针的比率仅为1.2甚至更少。实验结果证实含次黄嘌呤碱基的新探针更加优越的杂交特异性，为探针的优化设计提供了一种更可行的调变手段。
　　⑵含次黄嘌呤碱基探针在检测多样本单SNP位点上的应用。首先将含次黄嘌呤碱基探针在聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物DNA芯片中进行SNP分型研究。将PCR产物芯片与双色荧光标记的一对含次黄嘌呤碱基探针杂交，实验结果与Sanger测序结果相一致，证实该类探针具有优越的杂交特异性。最后，利用这种方法实现对140个样本rs988748位点的分型，为DNA芯片大样本筛选SNP位点提供一种可选的探针形式。
　　⑶含次黄嘌呤碱基新探针在检测单样本多位点上的应用。将固定含次黄嘌呤碱基探针的DNA芯片与标记的PCR产物杂交，以分析单样本的多个核酸片段。在对探针进行优化，确定探针形式后，用三对特异探针分别与标记的PCR产物杂交实现了3个SNP位点（rs988748 C/G、rs4148323 G/A和rs56059937T/C）的准确的分型。在选择合适的杂交温度后，在同一张DNA芯片上实现3个SNP位点的分型检测，为临床DNA芯片设计提供了一种可选的探针形式。

目录

声明

摘要

缩写及术语表

第一章 绪论

1．1 DNA芯片技术

1．1．1 DNA芯片的概念

1．1．2 DNA芯片的制备

1．1．3 DNA芯片的应用

1．2 DNA芯片的杂交特异性

1．2．1 杂交特异性的概念

1．2．2 提高DNA芯片杂交特异性的方法

1．3 本课题的研究目的和内容

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究内容

第二章 含次黄嘌呤碱基探针的杂交性能研究

2．1 引言

2．2 含次黄嘌呤碱基探针的杂交原理

2．3 材料与方法

2．3．1 实验材料

2．3．2 实验方法

2．4 结果与讨论

2．4．1 含次黄嘌呤碱基新探针的优化比较

2．4．2 反应条件的优化

2．4．3 含次黄嘌呤新探针与传统探针的杂交特异性和灵敏度比较

2．5 结论

第三章 含次黄嘌呤碱基探针检测多样本单SNP位点

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 DNA样本的物理检测

3．3．2 PCR产物的物理检测

3．3．3 小样本PCR产物的SNP分型

3．3．4 反应条件优化

3．3．5 大样本PCR产物的SNP分型

3．4 结论

第四章 含次黄嘌呤碱基探针检测单样本多SNP位点

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 PCR产物的物理检测

4．3．2 传统探针的杂交特异性比较

4．3．3 含次黄嘌呤新探针的杂交特异性比较

4．3．4 单个位点的SNP分型

4．3．5 三个SNP位点的同时检测

4．4 结论

第五章 总结与展望

5．1 论文工作的主要内容和研究成果

5．2 后续工作中需要解决的问题

参考文献

附录

作者简介

致谢