“中低温低流量”脑损伤SD大鼠模型的制作以及缺血预适应脑保护作用机制的研究

摘要

[目的] 制作成年雄性SD大鼠中低温低流量(MHLF)的脑损伤模型，进行表型分析，观察成年雄性SD大鼠模型中使用缺血预适应的策略进行脑保护的结果，并进一步研究其通过线粒体相关凋亡通路及其上游的信号通路发挥脑保护作用的机制。 [方法] 180只健康的成年雄性SD大鼠（8～10周龄，体重76-85 g）随机的分为三组:假手术组、手术组和缺血预适应组，每组60只。手术组在SD大鼠的肛温降至(25±0.5)℃时阻断两侧颈总动脉120m in后再重新开放，模拟临床上脑部中低温低流量的状态。假手术组除不阻断两侧颈总动脉外，其余的操作均相同。缺血预适应组在120分钟双侧颈动脉阻断前行缺血预适应，即阻断双侧劲总动脉2分钟后再灌注5分钟，反复循环4次，之后与手术组一样，阻断两侧颈动脉120分钟再重新开放。另取成年雄性健康SD大鼠(8～10周龄，体重76-85g)30只，随机的分为三组:假手术组、手术组和缺血预适应组，每组10只。利用激光多普勒血流仪监测假手术组、手术组和缺血预适应组(n=10)大鼠的局部脑血流量(rCBF)，并记录在降温前、降温至(25.0±0.5)℃、MHLF0～5 min、MHLF10～15 min、MHLF30～35 min、MHLF55～60 min、MHLF65～70 min、MHLF75～80 min、MHLF85～90 min、MHLF105～110 min、MHLF115～120min和再灌注后0～5 min，复温等十二个时间段的局部脑部血流量。对于前述180只雄性SD大鼠，我们根据再灌注后的时间随机的把每组60只雄性SD大鼠再分成5个亚组，每组12只:分别为再灌注后1h，6h，24 h，72 h和7d。通过TUNEL法检测三组SD大鼠脑组织的细胞凋亡水平，利用免疫组织化学与RT-PCR法检测各亚组对应的时间点中细胞色素C和caspase-3等线粒体凋亡通路相关蛋白的表达水平以及mRNA等表达变化情况，利用western blot检测细胞色素C、caspase-3与caspase-9以及其上游BCL-2与BAX以及AKT等蛋白的变化。 [结果] 成年雄性SD大鼠的局部脑血流量(rCBF)在手术组和缺血预适组的MHLF期间均下降了约84％左右。其手术组的rCBF、内环境等指标的变化趋势与临床MHLF中脑血流灌注水平，内环境变化趋势等基本一致。缺血预适应组的SD大鼠在再灌注6h，24 h，72 h和7d等各时间点死亡率均低于手术组，其脑组织病理改变较轻，脑组织损伤显著低于手术组，同时，TUNEL染色显示凋亡细胞数量在再灌注后6h，24 h，72 h和7d等各时间点较手术组均显著下降(P＜0.05or P＜0.01)，并且免疫组化提示与手术组相比较，缺血预适应明显抑制了上述四个对应时间点的线粒体凋亡信号通路相关蛋白，细胞色素C与caspase-3的释放与活化等(P＜0.05 or P＜0.01)。RT-PCR显示线粒体凋亡通路中的细胞色素C与caspase-3的mRNA表达水平在再灌注24 h与72 h表达水平较手术组明显减少(P＜0.05 or P＜0.01)。Western blot的结果显示在再灌注24h后细胞色素C与caspase-3的蛋白表达与上述结果一致，caspase-9在缺血预适应组的表达在再灌注24h后较手术组也显著减少(P＜0.05 or P＜0.01)。在调控的上游基因中，缺血预适应组的BCL-2与AKT等蛋白的表达较之于手术组增强，而BAX的表达较手术组减弱(P＜0.05 or P＜0.01)。 [结论] 本研究中制作的中低温低流量SD大鼠的脑损伤模型，其病理生理变化近似于临床上主动脉夹层手术中MHLF的脑部缺血再灌注的过程，模型制作成功。缺血预适应通过减少细胞DNA的断裂、阻止线粒体凋亡通路中细胞色素C的释放以及抑制了caspase-3、caspase-9等的活性从而发挥了脑保护的作用;同时，本实验研究发现其上游BCL-2、BAX以及AKT等基因与蛋白的相关变化，显示缺血预适应通过PI3K/Akt信号通路的这些节点抑制了线粒体凋亡通路的活性从而产生了脑保护作用的机制。缺血预适应可能成为临床上防治中低温低流量术后神经系统损伤新的治疗方法，而AKT蛋白可能成为新的分子治疗靶点。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 SD大鼠中低温低流量(MHLF)脑损伤模型的制作与表型分析

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 缺血预适应对大鼠中低温低流量脑保护作用的分析与机制研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 主动脉夹层(Debakey Ⅰ型)手术中使用中低温或浅低温低流量脑保护效果的研究综述

附录一：英文缩略词

附录二：博士在读期间科研工作小结

致谢