1-磷酸鞘氨醇及中性神经酰胺酶保护炎症因子引起的胰岛β细胞凋亡

摘要

1-磷酸销氨醇及中性神经酰胺酶保护炎症因子引起的胰岛β细胞凋亡 目的： (1)观察外源性1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)是否减少炎症因子引起的胰岛β细胞凋亡。 (2)探讨S1P保护胰岛β细胞的可能机制。 (3)观察胰岛β细胞是否存在中性神经酰胺酶(neutral ceramidase，N-CDase)活性及表达。 (4)观察炎症因子刺激是否引起胰岛β细胞N-CDase的活性及表达变化。 (5)观察抑制N-CDase活性是否影响炎症因子引起的胰岛p细胞凋亡。 方法： (1)贴壁法培养大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞，联合应用炎症因子白介素-1β(IL-1β，5 ng/mL)、肿瘤坏死因子(TNF-a，10 ng/mL)和干扰素一γ(IFN-γ，50 ng/mL)刺激INS-1细胞24 h，流式细胞术检测细胞凋亡。 (2)1μMS1P预处理INS-1细胞1 h，随后，应用炎症因子及S1P与INS-1细胞共培养24 h，流式细胞术检测细胞凋亡。 (3)western-blot方法检测凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3的表达。 (4)应用有机萃取和高效液相色谱(HPLC)方法定量测定正常培养以及炎症因子刺激下INS-1细胞的N-CDase的活性。 (5)采用半定量RT-PCR和定量real-time PCR方法测定正常培养以及炎症因子刺激下INS-1细胞的N-CDase基因表达，western-blot方法检测N-CDase蛋白表达。 (6)应用N-CDase抑制剂D-MAPP(终浓度为10μM)抑制INS-1细胞N-CDase活性，HPLC方法测定抑制后酶活性的降低。 (7)应用D-MAPP与炎症因子共培养INs-1细胞24 h，流式细胞术测定细胞凋亡。 结果： (1)INS-1细胞贴壁生长状况良好，正常培养条件下凋亡不明显；而联合应用炎症因子IL-1β、TNF-αIFN-γ刺激24 h后INS-1细胞出现明显凋亡。 (2)应用1μMS1P预处INS-1细胞并与细胞共培养，能显著减少炎症因子引起的细胞凋亡。 (3)应用1μMS1P预处理并与INs-1细胞共培养，能显著抑制炎症因子刺激下的细胞cleaved-caspase-3的表达。 (4)正常培养的INS-1细胞存在一定的N-CDause活性，炎症因子刺激能明显增加INS-1细胞的N-CDase活性：最早在刺激8 h后即能观察到N-CDase活性明显增加，在刺激16 h后达到高峰，并且，这种增加在刺激24 h后仍能被检测到。 (5)炎症因子刺激能明显增加INs-1细胞的N-cDase蛋白表达，并与其活性增加的时间依赖性较一致。 (6)炎症因子刺激能明显增加INs-1细胞的N-CDase基因表达，在刺激4h后出现N-CDase基因表达显著增强，刺激12h后达到高峰。 (7)应用10μMD-MAPP预处理及与INs-1细胞共培养，能明显降低正常培养和炎症因子刺激的INS-1细胞的N-CDase活性。 (8)应用10μMD-MAPP预处理及与INS-1细胞共培养，能明显增加炎症因子刺激引起的INS-1细胞凋亡。 结论： (1)联合应用炎症因子刺激24 h能引起INS-1细胞凋亡，而外源性S1P能减轻炎症因子引起的细胞凋亡。 (2)S1P可能通过抑制凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3表达，从而减轻炎症因子引起的INS-1细胞凋亡。 (3)INS-1细胞存在N-CDase活性，炎症因子刺激可引起N-CDase的活化，并且，其活性增高可能与对抗炎症因子引起的细胞凋亡有关。

目录

论文说明：英文缩写及注释

声明

研究背景

第一部分1-磷酸鞘氨醇保护炎症因子引起的胰岛β细胞凋亡

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分炎症因子引起胰岛β细胞中性神经酰胺酶活性增高

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分抑制中性神经酰胺酶促进炎症因子引起的胰岛β细胞凋亡

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

结论与展望

致谢

在读期间发表的论文与综述

综述 内质网应激与糖尿病相关性研究进展