1-磷酸鞘氨醇抑制C2-神经酰胺诱导小鼠早期胚胎凋亡的作用机制

摘要

[研究背景]
　　 细胞凋亡参与卵母细胞受精障碍、胚胎发育停滞，从而导致体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)失败。因而，抗凋亡干预胚胎发育过程可能成为改善胚胎发育潜能、提高胚胎质量和IVF-ET成功率的潜在途径。研究发现体外培养的人类植入前胚胎中大约有75％的胚胎存在不同程度的细胞内碎片和不对称性，其中大约50％的胚胎在第一周内停止发育。然而导致胚胎丢失的原因尚不清楚，可能包括染色体异常，培养条件欠佳或卵母细胞成熟障碍。也有研究发现发育停滞的胚胎及碎片多的胚胎中细胞凋亡发生比率增高。因而，本研究通过在胚胎体外培养基中添加抗凋亡因子以期降低细胞凋亡程度、提高胚胎质量。
　　 鞘脂类是细胞膜上普遍存在的一种成分，其代谢产物1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)既可通过胞外受体途径又可作为胞内第二信使发挥着重要的生理学功能，如调控细胞存活、生长、增殖和凋亡。S1P不但可以抑制辐射、热刺激等诱发的卵巢、卵母细胞以及男性生殖发生细胞凋亡，而且外源性S1P可减少早期胚胎细胞凋亡从而改善胚胎发育潜能。大部分鞘脂代谢产物是具有生物活性的，其中神经酰胺(ceramide，Cer)和鞘氨醇(sphingosine，Sph)是细胞凋亡的激活因子，而1-磷酸鞘氨醇(S1P)能够促进细胞存活和增殖，应激因子激活鞘磷脂酶产生神经酰胺，促进细胞凋亡;存活因子激活鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase，SphK1)致S1P增加而抑制Cer诱导的细胞凋亡作用。细胞内S1P和Cer间的动态平衡构成了“鞘磷脂变阻器(sphingolipidrheostat)”，因S1P和Cer发挥相反的生物学效应，且在细胞内可相互转化，S1P/Cer的比值变化可导致“sphingolipid rheostat”失衡，而S1P和Cer间的动态平衡是决定细胞命运的重要因素。本课题前期研究发现，25nMS1P可提高体外培养小鼠早期胚胎的囊胚形成率并降低2-4细胞期胚胎阻滞率和有碎片的胚胎率，而50μM C2-神经酰胺(C2-ceramide，CED)即可显著降低体外培养小鼠胚胎的囊胚形成率并使得2-4细胞期阻滞胚胎率和有碎片的胚胎率增加（与空白对照组比较）。因此，本研究通过在体外胚胎培养基添加25nMS1P和50μM CED，追踪观察小鼠胚胎体外发育情况，采用TUNEL、CASPASE原位荧光细胞凋亡检测技术检测小鼠早期胚胎细胞凋亡情况，探讨S1P能否抑制CED诱导的胚胎细胞凋亡、提高胚胎发育潜能。
　　 全基因表达谱芯片技术作为基因组学研究的工具，可同时监测大量基因在胚胎不同发育时期的表达变化，从而成为研究发育相关基因的有效工具。利用芯片技术已经对小鼠植入前胚胎发育、小鼠小脑发育等过程基因表达进行了研究。故本研究采用全基因表达谱芯片技术分别分析CED、CED和S1P同时处理后小鼠早期胚胎中基因表达谱变化情况，分析参与CED促进胚胎细胞凋亡和S1P抑制胚胎细胞凋亡过程中的信号转导通路及参与凋亡通路的相关基因。
　　 肿瘤抑制基因p53调控细胞周期进程、DNA修复和细胞凋亡等细胞内生物学过程。p53基因也能够通过诱导不同促凋亡基因表达激活死亡受体和线粒体凋亡通路。早期研究发现在肿瘤应激反应中，p53作为神经酰胺作用的下游靶点。而且在神经酰胺诱导的SKN-SH细胞凋亡过程中发现p53调控Bcl-2/Bax比例和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease，caspase)表达/激活比例。因此，本研究中采用荧光定量PCR技术检测凋亡基因p53在小鼠早期胚胎中的表达情况，探讨S1P抑制早期胚胎凋亡的可能机制，为S1P抗凋亡干预改善胚胎发育技术应用于体外受精-胚胎移植临床治疗提供实验依据。
　　 第一部分1-磷酸鞘氨醇、C2-神经酰胺对小鼠两细胞期胚胎基因表达谱的影响
　　 [目的]
　　 通过分析C2-神经酰胺(CED)、C2-神经酰胺和1-磷酸鞘氨醇(S1P)同时处理后小鼠两细胞期胚胎中全基因表达谱变化，了解其中差异性表达基因情况，探讨参与S1P抑制胚胎细胞凋亡、CED诱导胚胎凋亡过程中的信号转导途径及参与凋亡通路的相关基因。
　　 [方法]
　　 1.将体内受精体外培养获得的受精卵随机分为四组:空白对照组，CED组，CED+甲醇组，CED+S1P组，体外培养24h。
　　 2.分别提取上述四组中小鼠两细胞期胚胎的Total RNA，采用小鼠全基因表达谱芯片（Affymetrix GeneChip(@)Mouse Genome4302.0 Array）进行微阵列实验。Affymetrix GeneChip(@)芯片有4500个探针，可检测约34000个已确定的小鼠基因。
　　 3.通过GeneChip(@)操作系统获得每个基因表达值，并通过各组间的比较决定基因表达信号值差异。差异性表达基因定义为基因表达变化大于2倍。采用Cluster3.0对所有芯片基因进行聚类分析，并将检测到的差异性表达基因输入生物学数据库Gene Ontology(GO)和KEGG进行GO分析和Pathway功能分析。
　　 [结果]
　　 1.应用Cluster3.0软件进行聚类分析，比较空白对照组与CED组、CED组+甲醇组及CED+S1P组小鼠两细胞期胚胎中基因表达谱变化。结果显示，与空白对照组相比，CED、CED+甲醇及CED+S1P处理后两细胞期小鼠胚胎的基因表达谱发生变化，且其表达谱变化趋势相似。
　　 2.使用SAM软件对微阵列实验结果进行标准化和分析。将CED组、CED+甲醇组与空白对照组的基因表达谱进行比较，发现差异性表达基因1466个，上调408个，下调1058个。其中与细胞凋亡相关差异性表达基因63个，上调29个，下调34个;其中包括抗凋亡基因12个，6个上调，6个下调。将差异性表达基因输入KEGG通路进行Pathway分析，结果显示差异性表达基因参与的凋亡相关信号通路包括促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导通路、细胞周期、p53信号通路、氧化应激及细胞凋亡信号转导通路。
　　 3.将CED+S1P组与CED组、CED+甲醇组的基因表达谱比较，发现差异性表达基因51个，上调26个，下调25个。其中与细胞增殖相关基因3个:Cdkn1b、Fgfr2（上调），Scarb1（下调）;与细胞分化相关基因1个:Nav1（下调）;与细胞凋亡相关基因一个3个:Tgm2（上调），Traf3、Atm下调。Pathway分析差异性表达基因参与的凋亡相关通路包括细胞周期、p53信号通路、细胞凋亡及MAPK信号转导通路。上述通路包含差异性表达基因Cdkn1b、Atm、Fgfr2，其中Cdkn1b、Fgfr2上调，Atm下调。
　　 [结论]
　　 1.CED、S1P处理后小鼠基因表达谱发生改变，且CED组、CED+甲醇组、CED+S1P组小鼠基因表达谱变化趋势相似。
　　 2.CED影响小鼠两细胞胚胎中凋亡相关基因、抗凋亡基因及凋亡通路相关基因表达变化，既有上调又有下调。
　　 3.S1P可能通过上调基因Cdkn1b、Fgfr2促进胚胎细胞增殖、下调基因Atm抑制胚胎细胞凋亡。且S1P可能通过细胞周期、p53信号通路、细胞凋亡及MAPK等信号转导通路抑制小鼠胚胎凋亡。
　　 第二部分1-磷酸鞘氨醇、C2-神经酰胺在小鼠早期胚胎发育过程中的作用
　　 [目的]
　　 通过分析抗凋亡因子1-磷酸鞘氨醇(S1P)和和促凋亡因子C2-神经酰胺(CED)对小鼠早期胚胎发育的影响，探讨S1P子在抑制早期胚胎凋亡和促进早期胚胎发育中的可能作用机制，了解细胞凋亡调控基因p53在早期胚胎发育中所起作用。
　　 [方法]
　　 1.将小鼠胚胎体外培养至囊胚期，跟踪观察胚胎细胞数目变化及形态变化，计算囊胚形成率及细胞凋亡数目。
　　 2.采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)检测和Caspase原位荧光凋亡检测技术分析小鼠早期胚胎的细胞凋亡情况。
　　 3.采用荧光定量PCR(Real-time PCR)检测小鼠早期胚胎发育过程中凋亡基因p53表达水平。
　　 4.实验分组:空白对照组，CED组，CED+甲醇组，CED+S1P组。
　　 [结果]
　　 1.空白对照组中有81.3％、CED+S1P组中65.3％的胚胎发育至囊胚期，而CED组和CED+甲醇组中分别有24.1％、27.9％的胚胎发育至囊胚期(P＜0.01)。体外培养的胚胎中，与空白对组及CED+S1P组比较，CED组中66.34％、CED+甲醇组61.33％的胚胎在桑椹胚期发育停滞(P＜0.05)。
　　 2.CED组和CED+甲醇组的Caspase绿色荧光信号高于空白对照组和CED+S1P组。TUNEL检测发现CED组及CED+甲醇组中细胞凋亡信号显著多于CED+S1P组及空白对照组。
　　 3.CED组（9.3±0.7）和CED+甲醇组（8.7±0.5）的囊胚凋亡细胞数显著高于空白对照组（1.3±0.3）和CED+S1P组(3.2±0.6)(P＜0.05)。CED组（81.3±5.1，n=26）、CED+甲醇组（83.9±5.4，n=26）、空白对照组（89.3±4.5，n=27）与CED+S1P组（(84.1±5.2， n=26)四组间的胚胎细胞总数无统计学差异。
　　 4.荧光定量PCR(Real-time PCR)检测CED组和CED+甲醇组p53 mRNA表达水平较空白对照组和CED+S1P组显著增高(P＜0.05)。
　　 [结论]
　　 1.CED可显著降低小鼠胚胎囊胚形成率，增加桑椹胚期p53基因表达水平，增加囊胚期分裂球细胞凋亡。
　　 2.S1P可部分抑制CED对小鼠早期胚胎发育的影响，提高小鼠胚胎囊胚形成率，减少囊胚期分裂球细胞凋亡，降低桑椹胚期p53基因表达水平。
　　 3.S1P可通过降调p53基因表达抑制CED对小鼠早期胚胎发育的影响。

目录

摘要

前言

第一部分 1-磷酸鞘氨醇、C2-神经酰胺对小鼠两细胞期胚胎基因表达谱的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二部分 1-磷酸鞘氨醇、C2-神经酰胺在小鼠早期胚胎发育过程中的作用

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

全文小结

参考文献

缩写词简表

综述

致谢

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