EGCG抑制UVB及UVA诱导的人皮肤成纤维细胞MMP-1水平及其相关分子机制的实验研究

摘要

研究背景： 太阳光中的紫外线(UV)辐射是一种非常显著的环境因子，它主要作用于人的皮肤。根据波长大小，太阳光中的紫外线可以分为三类：1)长波紫外线(UVA)，波长为320～400mm，是长波紫外线，几乎全部到达地面，能穿透真皮；2)中波紫外线(UVB)，波长为280～320nm，可以穿透皮肤，大部分可到达地面；3)短波紫外线(UVC)，波长为200～280nm，均被臭氧层所吸收，不能到达地面。UVA主要作用于真皮，其深度可达真皮中部，成纤维细胞是其作用的主要靶部位，UVB部分可达真皮浅层，成纤维细胞是其靶部位之一。 日光中的UVA和UVB除对皮肤癌有启动和促进作用外，更重要的是紫外线辐射极易促进皮肤老化过程。真皮胶原结构改变为光老化重要机理之一。光老化在真皮表现为真皮胶原降解增多，弹力纤维变性，从而产生皱纹和皮肤弹性减小。基质金属蛋白酶(MMPs)是降解细胞外基质(ECM)的一类重要的蛋白水解酶类，通过水解、破坏及重组ECM，最终导致皮肤结缔组织结构重建，引起皮肤老化的临床表现。丝裂素活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)是一种序列极端保守的苏氨酸和丝氨酸双位磷酸化的酶系，在氧化、紫外线、神经递质及激素等多种不同应激介导因素下将细胞外信号传递到细胞核内，通过精细调节、调控基因转录、蛋白质翻译和新陈代谢等，为细胞内主要的信号转导系统之一。近年来发现c-Jun氨基端激酶(JNK)为MAPK通路的关键分子之一，参与了皮肤光老化的信号转导过程。JNK和p38被磷酸化后最终启动转录因子激活蛋白(AP)1。AP1为MMPs转录所必需，从而促使MMPs高表达。通过特异性抑制JNK磷酸化过程，可抑制MAPKs信号通路参与的光老化、炎症反应、凋亡及增殖过程。表没食子儿茶素没食子酸(epigallocatechingallate，EGCG)是茶多酚的主要活性成分(50％)，有抗突变、抗氧化、抗病毒、调节免疫功能和诱导肿瘤细胞凋亡等作用。国内外研究已证实绿荼提取物活性成份EGCG可抑制UV照射导致的皮肤水肿、松弛及增厚，具有光保护作用。本项目旨在研究和对比UVB及UVA照射对培养状态下人皮肤成纤维细胞(FB)表达MMP-1 mRNA及蛋白水平的影响，并以JNK特异性抑制荆SP600125为阳性参照探讨EGCG的光保护作用机制与MAPK信号通路的相关性，籍此可为绿茶及其提取物作为天然防晒剂应用于对UVA及UVB两种波长紫外线的防护开发提供理论证明和实验数据参考。 目的： 观察UVA及UVB照射对培养状态下人皮肤成纤维细胞(FB)MMP-1mRNA及蛋白水平表达的影响以及加入EGCG或信号蛋白JNK特异性抑制剂的干预作用；观察UVB照射对培养状态下人皮肤成纤维细胞磷酸化JNK(p-JNK)蛋白表达的影响以加入EGCG或信号蛋白JNK特异性抑制剂的干预作用，籍此探讨EGCG抑制Uv诱导的人皮肤成纤维细胞MMP-1分泌作用及其对相关调控分子影响，可为天然防晒剂的开发和实际应用提供理论依据扣实验数据参考。 方法： 　　1.细胞培养：分离获得汉族青年包皮环切术后皮肤成纤维细胞(FB)，在37℃、5％CO2条件下培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基，调整细胞密度为1 × 106/ml，根据实验目的不同分别定量接种在6孔板以及96孔板中，细胞80％融合时照射中波紫外线(UVB)。 2.紫外线照射：根据实验设计定时定量进行UVB或UVA照射，于照射前后加入相关药物进行干预处理。 3.细胞活性检测：MTT法检测细胞增殖活性。 4.MMP-1蛋白水平检测：ELISA法检测MMP-1蛋白水平。 5.MMP-1mRNA表达检测：RT-PCR法检测MMP-1mRNA表达。 6.JNK蛋白磷酸化水平检测：Western blotting法检测磷酸化JNK(p-JNK)蛋白表达。 结果： 1.EGCG或SP600125干预对UVB或UVA照射诱导MMP-1分泌水平的影响。单纯EGCG或SP600125处理FB后各组间MMP-1分泌无差异(P＞0.05)。单纯UVB或UVA照射组较未照射不加药组MMP-1分泌显著增加，前两者分别为后者的3.10倍及1.82倍(P<0.05)。UVB照射前后加EGCG或SP600125使MMP-1分泌减少，该两组MMP-1分泌水平分别为单纯UVB照射组的61.8％及48.9％(P<0.05)。与此类似，UVA照射前后加EGCG或SP600125也使MMP-1分泌减少，该两组MMP-1分泌水平分别为单纯UVA照射组的66.7％及70.9％(P<0.05)。 2.UVB或UVA对FB MMP-1mRNA转录表达的时效性影响。UVB照射FB后12h及24hMMP-1mRNA表达较正常对照组显著增加(P<0.05)，分别为未照射组的2.60倍及2.66倍。 UVA照射FB后24hMMP-1mRNA表达增加，为未照射组的1.98倍(P<0.05)。 3.EGCG或SP600125对UVB或UVA照射诱导MMP-1mRNA转录表达水平的影响。单纯UVB照射组MMP-1mRNA转录表达较非照光的三组显著增加，EGCG/SP600125处理的UVB两组较单纯UVB照射组均显著抑制MMP-1mRNA转录水平表达(P<0.05)，该两组灰度分别为单纯照射组的71.9％及40.4％。单纯UVA照射组MMP-1mRNA转录表达较非照光的三组显著增加，EGCG/SP600125处理的UVA两组较单纯UVA照射组均显著抑制MMP-1mRNA转录水平表达(P<0.05)，该两组灰度分别为单纯照射组的62.2％及68.3％。非照射UVA或UVB照射的三组间MMP-1mRNA表达无差异(P>0.05)。 4.UVB照射FB后p-JNK表达的时效性及EGCG对UVB照射诱导p-JNK蛋白表达水平的影响。p-JNK蛋白于UVB照射后1/2h表达增加，于照射后6h开始下降。单纯UVB照射组p-JNK表达较非照光的三组显著增加，其中单纯UVB照射组与正常对照组的灰度比值为1.68，EGCG/SP600125处理的UVB的两组较单纯UVB照射组p-JNK水平表达降低(P<0.05)，该两组灰度分别为单纯UVB照射组的27.9％7&32.4％。非UVB照射的三组间p-JNK蛋白表达差异无统计学差异(P>0。05)。 结论： UVB或UVA照射成纤维细胞后MMP-1mRNA转录及其蛋白分泌水平均显著增加，且趋势相同，但就量效及时效作用而言UVB的光损伤作用强于UVA。EGCG或SP600125可同时抑制UVB及UVA诱导的MMP-1蛋白分泌及mRNA转录水平。p-JNK蛋白于UVB照射后1/2h表达增加，于照射后6h表达下降。EGCG或SP600125均可抑制UVB诱导的p-JNK蛋白高表达。EGCG对UVA或UVB照射FB的光保护作用可能与抑制JNK参与的MAPK信号转导通路，以及进而抑制MMP-1水平和活性有关。

目录

论文说明：中英文对照及缩略语

声明

全文技术流程图(flow chart of techniques)

摘要

引言

第一部分 EGCG干预对UVB或UVA照射FB诱导MMP-1蛋白分泌水平的影响

材料与方法

结果

讨论

第二部分 EGCG干预UVB或UVA照射FB诱MMP-1mRNA表达水平的影响

材料与方法

结果

讨论

第三部分 EGCG干预对UVB照射FB诱导p-JNK分泌水平的影响

材料与方法

结果

讨论：

全文小结

参考文献

附录一：硕士在读期间发表文章

附录二：综述：基质金属蛋白酶与皮肤病相关性

致谢