视蛋白基因3（OPN3）对人肺癌A549细胞紫杉醇耐药性作用机制的初步研究

摘要

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康，以非小细胞肺癌多见，而化学治疗是其主要的治疗手段。但随着化疗药物的广泛使用，肿瘤耐药性也不断出现，严重影响了治疗效果。耐药性是由基因决定的，因此，发现和研究肿瘤耐药性相关基因及其作用的分子机制，有助于进行针对性的临床治疗，为研究新的药物作用靶点和治疗方法提供依据，其已成为当前肿瘤防治研究的重点课题。 本室前期研究表明，与淡色库蚊对杀虫剂抗性相关视蛋白基因高度同源的人视蛋白基因3(Opsin3,OPN3)与人肺癌A549细胞紫杉醇耐药性相关，推测其可能作为G蛋白偶联受体(GPCR)成员。参与了肺癌A549细胞对紫杉醇的耐药机制。 本研究采用G蛋白偶联受体信号通路基因芯片，对A549紫杉醇敏感细胞转染伽及其空载体对照组、A549PTX紫杉醇耐药细胞干涉OPN3及其空载体对照组共4种细胞系，紫杉醇处理前后2种状态，共8组样品进行高通量筛选，以研究OPN3对其他G蛋白偶联受体及GPCR下游信号通路的影响；采用定量PCR及Western Blot验证目的基因及蛋白质表达差异，研究其对A549细胞紫杉醇耐药影响的可能机制。结果表明，OPN3可以抑制c-Jun表达，从而降低下游基因转录、抑制细胞增殖，增加肿瘤细胞对药物的敏感性。 同时，本研究采用使用annexin V/propidium iodide(PI)双染，流式细胞仪结合荧光显微镜对芯片实验样本细胞进行凋亡检测。结果表明，OPN3相对表达水平与A549细胞在紫杉醇处理下的凋亡水平正相关，提示OPN3可能还上调细胞凋亡信号通路，诱导细胞凋亡。这一结果与前期3H-TdR增殖试验结果相符。 本研究初步研究了OPN3在肺癌耐药性中的功能，首次发现OPN3对A549细胞紫杉醇耐药性的影响包括抑制c-Jun表达和促进细胞凋亡2方面，为深入研究视蛋白基因在耐药性产生机制中的作用、发现新的肿瘤基因治疗位点奠定了基础。

目录

声明

前言

材料与方法

1.材料

1.1.细胞系

1.2.主要试剂

1.3.主要溶液配方

1.4.主要仪器

2.方法

2.1.基因芯片

2.2.荧光定量PCR

2.3.Western Blot

2.4.细胞凋亡检测

结果

1.基因芯片

1.1. RNA提取

1.2.芯片基本数据

1.3.数据分析

2.荧光定量PCR

2.1.RNA提取

2.2.OPN3转染/干涉效果验证

2.3.BCL-2、CCND1、c-Jun、EDG-2表达水平验证

3.Western Blot

3.1.蛋白质定量

3.2.Western Blot鉴定c-Jun表达差异

4.细胞凋亡检测

4.1.流式细胞仪检测

4.2.荧光显微镜检测

讨论

小结

参考文献

附录：糖原分支酶基因(NYD-GBE)的初步功能研究

在读期间已拟发表论文目录

致射

综述：胰蛋白酶在肿瘤发生发展中的作用