多种核酸扩增技术研究及其在线粒体DNA检测中的应用

摘要

人类线粒体基因组DNA分子为一个16569bp的双链环状DNA分子，该基因组与核基因组相互独立又互相依存，线粒体有13个编码基因，22个tRNA和2个rRNA，许多疾病都与线粒体基因组相关。线粒体又有独特的母系遗传特性，是研究生物起源和进化的重要材料。K562细胞是人类慢性髓系白血病细胞，该细胞容易获取，具有各种分化特性，是实验室研究的重要材料。随着人类基因组计划的完成，各种测序手段相继出现，人们在获取遗传序列信息方面更加方便，利用测序手段研究线粒体基因组，对其进行正确的拼接和后续的功能注释在诊断线粒体疾病，保护生物学和群体遗传学，以及确定线粒体在进化上的地位都有重要作用意义。本论文以K562细胞线粒体基因组为研究对象，通过实验的方法设计了一组对比实验，分别用基于PCR的方法和基于多重置换扩增的全基因组等温扩增来获得线粒体基因组，然后利用一代Sanger测序方法和二代Illumina测序方法对我们获取的线粒体基因组进行测序，最终获得了K562细胞线粒体基因组序列信息。
　　1、我们利用基于PCR的扩增方法，通过文献综述和预实验最终确定了45对线粒体扩增引物，对线粒体环状DNA分子的全长进行无缝扩增，每一个扩增片段长度不超过1000bp，每一个扩增片段的上下游都有一段的overlap。然后对这些扩增片段利用ABI的3730测序仪进行测序，获取每一个扩增片段的序列信息。对于一代测序下机数据，我们使用NCBI数据库的blast在线比对工具将我们的每一个扩增fragment与人类线粒体标准参考基因组(NC—012920.1)进行比对，然后手动对这些比对后的片段进行手动拼接，最终获得了K562细胞线粒体的完整基因组。
　　2、我们利用基于多重置换扩增的线粒体基因组等温扩增方法对我们的K562细胞线粒体基因组进行扩增。我们使用QIAGEN公司的REPLI-g Mitochondrial DNA kit对我们的K562核酸样本进行扩增，一般地线粒体DNA在提取过程中往往与核DNA很难分开，所以我们选择对K562全基因组中线粒体DNA进行特异性扩增。实验过程中我们对样本进行了不同程度的稀释，发现将样本稀释到0.1个核DNA的单倍量级时（即3.3pg/uL），再进行线粒体基因组扩增后10组平行样本中只有3个样本扩增出。根据我们的全基因组稀释样本的测序数据发现，在0.1个gDNA单倍量级时，线粒体DNA与gDNA的reads覆盖度之比在4-16倍之间，这与我们的实验结果比较类似，说明该线粒体基因组扩增试剂盒满足我们实验的要求。利用该试剂盒得到的线粒体基因组进行了二代Illumina测序。
　　3、一代测序数据在比对过程中，我们发现了39个单碱基突变位点和一个短片段缺失，这些突变位点分布在线粒体基因组的全长，包括rRNA、tRNA、D-Loop以及基因编码区。我们将这些突变位点分为编码区和非编码区两部分，对于编码区的突变位点分为错义突变和无义突变分别讨论相关的功能意义。我们利用的是NCBI基因数据库、MITOMAP线粒体基因数据库以及UniprotKB蛋白数据库对我们的突变位点进行查找，我们发现大多数突变位点都已经存在于这些数据库之中，我们根据查找到的信息对每个位点进行了功能注释，分析总结了各位点的生物学意义。对于少量数据库中查找不到的位点，我们利用Jpred蛋白质结构预测在线分析软件分析了这些位点改变造成的氨基酸改变进而可能对整个蛋白质结构造成的影响，并且分析了这种影响可能引起的功能变化。对于两种不同方法获得的线粒体基因组我们利用了二代Illumina测序方法进行了测序，并对两种方法得到的测序结果进行了初步的比较，并且对一代测序数据分析时得到的几个具有异议性的位点进行了二代测序方法的进一步分析。

目录

封面

声明

摘要

英文摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 线粒体基因组扩增技术的发展

1．2．1 基于PCR的线粒体基因组扩增技术

1．2．2 基于多重置换扩增技术(MDA)的线粒体基因组扩增方法

1．3 核酸测序技术的发展

1．3．1 第一代Sanger测序技术

1．3．2 第二代测序技术

1．3．3 第三代测序技术

1．4 K562细胞系研究

1．5 论文的主要研究内容

第二章 K562细胞的培养

2．1 引言

2．2 线粒体DNA检测研究的材料K562细胞的培养

2．2．1 K562细胞培养的材料与方法

2．2．2 K562细胞培养

2．3 本章小结

第三章 利用多种核酸扩增技术获得线粒体基因组

3．1 引言

3．2 基于PCR的K562细胞线粒体基因组的获取

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．2．3 实验结果与分析

3．2．4 K562细胞线粒体基因组DNA分子扩增产物测序与拼接

3．3 基于多重置换扩增技术的K562细胞线粒体基因组等温扩增

3．3．1 K562细胞线粒体基因组等温扩增

3．3．2 实验结果

3．3．3 基于稀释样本的REPLI-mt kit验证

3．3．4 对K562细胞线粒体基因组样本进行二代测序

3．4 本章小结

第四章 K562细胞线粒体基因组测序结果分析

4．1 引言

4．2 一代测序数据的比对、拼接

4．2．1 K562细胞线粒体基因组一代测序数据比对分析

4．2．2 K562细胞线粒体基因组一代测序数据拼接

4．3 一代测序数据SNP位点分析

4．3．1 编码区的SNP位点

4．3．2 非编码区的SNP位点

4．4 Illumina二代测序数据分析

4．4．1 两种不同方法获得的线粒体基因组进行二代测序后比对情况分析

4．4．2 利用二代测序数据对一代测序数据中异议的单碱基位点进行分析

4．5 本章小结

第五章 总结与展望

5．1 研究总结

5．2 工作展望

参考文献

致谢

附录

攻读硕士学位期间科研成果