抗人类疱疹病毒6型南京株E5单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

摘要

人类疱疹病毒6型(Human herpesvirus 6，HHV-6)是一类嗜人类淋巴细胞的双链DNA病毒，于1986年由美国癌症中心的Salahuddin等首先从淋巴增生及AIDS患者外周血单个核细胞中分离到，与人类疱疹病毒7型(HHV-7)及人巨细胞病毒(CMV)同属于疱疹病毒β亚科。目前认为HHV-6是婴幼儿急疹(ES)的病因，另外还与神经胶质瘤、脑膜脑炎、AIDS、慢性疲劳综合症、器官移植后感染、多发性硬化症等多种疾病有关，但其致病机理目前尚未清楚。 HHV－6基因组为一线性双链DNA分子，大小约160～170Kbp，结构上可分为3个部分，即序列独特区(UL区)，左右末端各有一个正向重复序列(DRL和DRR区)，且有119个开放读码框(ORF)。根据其基因结构差异和抗原性可分为HHV-6A、B两种亚型，GS、U1102是HHV-6A亚型代表株，而Z29是B亚型代表株，且序列的同源性在96％以上，HHV-6广泛存在于健康成人及儿童外周血淋巴细胞和唾液中，其原发感染一般发生在6个月～2岁的婴幼儿，高峰期在6～9个月，其后在体内建立持续性感染，并长期呈潜伏感染。 我室于1994年在国内首次分离鉴定出HHV－6南京地方株8株，并详细研究了南京株E5(CN5)的病毒学、免疫学、生物学特性及病毒形态学超微结构，为本次研究奠定了良好的基础。 本研究采用蔗糖密度梯度离心法纯化的南京株HHV-6 E5病毒抗原免疫8周龄、雌性BALB/c小鼠，采用常规方法融合，间接ELISA方法筛选，并经3次有限稀释法亚克隆后，获得3株能持续稳定分泌特异性抗HHV-6抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为JA9、JYE7、JYE8。将获得的3株杂交瘤细胞株传代扩增，注射到用Pristane预刺激的BALB/c小鼠体内制备腹水，并进行初步纯化。单抗Ig亚类鉴定表明：JA9为IgG1，κ亚型、JYE7和JYE8为IgM，λ亚型；腹水效价分别为1:0.8X105、1:0.256 X105、1:0.128 X105；杂交瘤细胞染色体计数显示3株细胞染色体数均约95条以上；间接免疫荧光实验显示：3株单抗均能与HHV-6 E5感染的CBMCs呈阳性反应，而与未感染CBMCs呈阴性反应；其中JA9单抗Western-blot实验结果进一步表明其可与HHV-6 E5约75ku大小的病毒蛋白结合。 本研究收集口腔肿瘤(口腔鳞癌及其癌前病变)、脑肿瘤(神经胶质瘤及脑膜瘤)、婴幼儿急疹、免疫抑制剂使用者(肾移植及肾病综合症)及健康人群唾液标本分别为41份、40份、36份、37份、40份，共194份。采用巢式PCR及ELISA法检测唾液标本中HHV－6的阳性率，结果患者的HHV－6阳性检出率均高于健康人群且有统计学意义。 本研究在自分离鉴定的HHV-6南京株E5的基础上，成功制备并初步鉴定出3株抗人类疱疹病毒6型南京株E5的单克隆抗体，将为HHV-6的进一步研究奠定基础，并为临床诊断提供了可能。

目录

论文说明：缩写词表

声明

引 言

第一部分 人类疱疹病毒6型的培养、鉴定及纯化

1.材料和方法

2.病毒抗原的纯化

3.结果

4.讨论

参考文献

第二部分 抗人类疱疹病毒6型单抗的制备与鉴定

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

参考文献

第三部分 抗HHV-6单克隆抗体在临床中的初步应用

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

参考文献

全文结论

致谢

硕士学习期间发表及待发表的论文与奖励

综述：人疱疹病毒6型基因编码蛋白研究进展

附录 HHV-6 E5(CN5)内引物PCR产物测序结果