行为和疾病相关的生物标志物检测方法的研究及应用

摘要

生物标志物在机体受到严重损害前可提供早期预警，不仅在临床诊断、环境评估等领域发挥巨大作用，在心理、行为等社会科学等领域也逐渐引起广泛的关注。建立生物样品中生物标志物快速、高效、准确的定性定量分析方法，对有关学科的研究和发展有重要意义。单胺类神经递质、组氨酸和皮质醇已被证明可以作为行为和疾病相关的生物标志物，本文主要对这几种物质的检测方法进行研究，并初步应用于实际样品的测定。
　　本文主要从以下几个方面开展工作:(1)利用复合组分纳米纤维材料建立人血浆中单胺类神经递质的样品前处理方法和高效液相色谱检测方法;(2)基于金属离子修饰的纳米纤维固相萃取实现快速前处理，建立高效液相色谱-紫外法测定唾液组氨酸;(3)采用聚苯乙烯纳米纤维固相萃取进行快速样品前处理，建立唾液皮质醇高效液相色谱-串联质谱检测方法;(4)唾液皮质醇测定新方法在人群心理和行为实验中应用研究;(5)探究唾液组氨酸应激响应特征。
　　论文的主要工作如下:
　　1、利用聚乙烯吡咯烷酮-聚苯乙烯复合组分纳米纤维固相萃取柱提取人血浆中的单胺类神经递质
　　本文建立了一个简单、快速、高效的样品预处理方法，以聚乙烯吡咯烷酮-聚苯乙烯复合组分纳米纤维作为吸附材料，制成纤维固相萃取柱(PFSPE)，提取人血浆中的单胺类神经递质。血浆样品无需沉淀蛋白和衍生，离心后直接取上清液加载到PFSPE柱中，用硫酸-甲醇混合溶液(1∶9，v/v)洗脱吸附在纤维上的目标物，用高效液相色谱-荧光检测器对待测物进行定性定量分析。方法的提取回收率为60.3％～72.5％。
　　2、基于金属离子修饰的纳米纤维作为固相萃取吸附剂联合高效液相色谱测定唾液组氨酸
　　本文研制了一种新型的聚苯乙烯-乙酸锌复合纳米纤维，并将其作为固相萃取吸附剂，装填制成固相萃取柱，联合高效液相色谱建立了唾液中组氨酸的定量分析方法。利用组氨酸和重氮化合物的偶氮反应，对唾液样品进行柱前衍生，并将棕红色产物过PFSPE柱，用含3％(v/v)1.45M碳酸钠(v/v)的水-甲醇混合溶液(v/v=4∶6)洗脱吸附在纤维上的目标物，用二极管阵列检测器在463nm波长下对待测物进行检测。
　　通过对衍生反应和提取条件的优化，得到该方法的最低检测限为0.03μg/mL，定量限为0.1μg/mL，线性范围为0.1μg/mL～5μg/mL，提取回收率为68.5％。该方法灵敏度高，选择性好，已成功地用于实际唾液样品中组氨酸的测定。
　　3、基于聚苯乙烯纳米纤维固相萃取技术的高效液相色谱-串联质谱法检测唾液皮质醇的研究
　　本文用聚苯乙烯纳米纤维固相萃取柱对样品进行预处理，建立了快速测定唾液皮质醇的高效液相色谱-电喷雾-串联质谱法。采用内标法定量，检出限为30 ng/L，有良好的准确性和精密度，操作简单，大大节省了分析时间和样品用量。
　　4、唾液皮质醇测定新方法在人群心理和行为实验中应用研究
　　将建立的唾液皮质醇检测新方法用于测定主题演讲被试唾液皮质醇水平，探究应激前后皮质醇浓度变化与焦虑状态和人格特质和相关性。结果显示，演讲应激后，被试的唾液皮质醇水平显著增加(p＜0.05)。被试初始皮质醇水平和状态焦虑量表得分呈显著正相关(r=0.497，p=0.001)。应激前后皮质醇的变化率和情绪稳定性量表得分呈显著正相关(r=0.395，p=0.016)。以上结果表明，唾液皮质醇对应激不仅有显著响应，且响应特征和人格特质有对应性。
　　5、唾液组氨酸检测在人群心理、行为研究中的应用
　　应激及其生物标志物，如唾液皮质醇，α-淀粉酶等，已经在学术界引起了广泛的关注。组氨酸是一种半必需氨基酸，对婴幼儿和动物的成长至关重要，但关于唾液组氨酸对应激响应的研究甚少。本次研究先后招募了八十名健康被试，设计了对照组和实验组，其中实验组被试接受寒冷刺激或主题演讲应激任务。本文旨在验证组氨酸作为应激标志物的可行性，并探究焦虑状态和人格特质对应激任务中被试唾液组氨酸浓度变化的影响。
　　结果显示，大约一半的被试在应激任务后组氨酸水平上升，另一半下降，且有统计学意义(p＜0.05）。主题演讲实验中，组氨酸变化率和状态-特质焦虑量表得分(r=0.49，p=0.002)以及情绪稳定性量表得分(r=0.37，p=0.021)呈显著正相关。寒冷刺激实验中，我们得到了同样的结果，即组氨酸变化率和状态-特质焦虑量表得分(r=0.78，p=0.000)以及情绪稳定性量表(r=0.52，p=0.018)呈显著正相关。本次研究表明，唾液组氨酸可以作为新的生物标志物应用于应激反应研究，其响应特征和焦虑状态、人格特质有对应性。

目录

声明

摘要

论文主要创新点

主要缩写词表

绪论

第一章 基于复合组分纳米纤维提取血浆单胺类神经递质

1．1 引言

1．2 实验部分

1．2．1 仪器

1．2．2 试剂

1．2．3 方法

1．3 结果和讨论

1．3．1 纤维表征

1．3．2 提取条件的优化

1．3．3 复合纳米纤维的绝对提取率

1．3．4 色谱图和方法学验证

1．3．5 吸附机理

1．4 结论

第二章 金属离子修饰的纤维快速提取-高效液相色谱测定法唾液组氨酸

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 仪器和设备

2．2．2 试剂

2．2．3 色谱条件

2．2．4 溶液的配制

2．2．5 纳米纤维的制备

2．2．6 纳米纤维的表征

2．2．7 唾液样品前处理

2．2．8 工作曲线的制备

2．3 结果和讨论

2．3．1 衍生条件的优化

2．3．2 纳米纤维固相萃取提取条件的优化

2．3．3 方法学研究

2．3．4 新方法在实际样品测定中的应用

2．4 结论

第三章 纤维萃取联合高效液相色谱-质谱测定唾液皮质醇

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 仪器与试剂

3．2．2 纳米纤维的制备

3．2．3 样品前处理

3．2．4 色谱质谱条件

3．2．5 工作曲线的制备

3．3 结果和讨论

3．3．1 线性关系考察

3．3．2 回收率和精密度

3．3．3 唾液样品预处理方法比较

3．3．4 质谱参数优化及质谱图

3．4 结论

第四章 唾液皮质醇检测方法在人群心理和行为实验中的应用

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 被试

4．2．2 实验材料

4．2．3 程序

4．2．4 主题演讲

4．2．5 样品采集和分析

4．2．6 数据统计

4．3 结果和讨论

4．3．1 人口学特征

4．3．2 唾液皮质醇对演讲应激的响应

4．3．3 焦虑状态和初始唾液皮质醇水平的关系

4．3．4 人格特质和唾液皮质醇的关系

4．3．5 焦虑状态和唾液皮质醇应激响应的关系

4．3．6 人格特质和演讲应激前后皮质醇变化率的关系

4．4 结论

第五章 唾液组氨酸检测在人群心理、行为研究中的应用

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 被试

5．2．2 应激实验

5．2．3 样品采集和分析

5．2．4 数据分析方法

5．3 实验结果

5．3．1 人口学特征

5．3．2 应激前后唾液组氨酸浓度变化

5．3．3 主题演讲实验中组氨酸应激响应特征和焦虑状态及人格特质的关系

5．3．4 寒冷刺激实验中组氨酸应激响应特征和焦虑状态及人格特质的关系

5．4 讨论

5．5 结论

参考文献

综述 几种生物标志物检测方法研究进展

致谢

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