间充质干细胞旁分泌物质诱导肝星状细胞凋亡的体外研究

摘要

研究背景： 肝硬化是严重危害人类健康的常见病之一，临床上尚无特效的治疗手段。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)治疗被认为是较有希望的新疗法，多个国家探索性地应用MSC移植治疗肝硬化，Ⅰ、Ⅱ期临床研究结果也非常令人鼓舞。多项研究结果显示肝硬化患者经外周静脉或门静脉输注MSC后，患者的肝功能好转，主要体现在胆红素、血清白蛋白以及MELD评分的改善，但具体机制尚不十分清楚。有观点认为可能与MSC直接分化为肝细胞或/和旁分泌途径有关。近来的研究发现，MSC经门静脉移植后在受损肝脏中定植率仅2-5％，仅极少数分化为功能性肝细胞，部分MSC通过与肝细胞融合而整合到肝脏。因此，MSC通过分化为肝细胞而起到治疗作用的观点受到质疑，MSC的旁分泌功能日益受到重视。有学者通过向肝损伤小鼠体内分别输注MSC和MSC条件培养液(Mesenchymal stem cell-conditioned medium，MSC-CM)发现两组的治疗效果无显著差别，证明MSC的治疗作用主要通过旁分泌功能而实现。在肝脏损伤环境中，MSC可以分泌不同水平的细胞因子及生长因子，表现出抗炎、促增殖等多种生物学作用，并能激活肝内的肝干细胞，促进肝细胞再生。进一步的研究发现MSC分泌的多种细胞因子、生长因子可以参与调节细胞的凋亡、增殖、炎症反应等生理过程，但其对肝纤维化的影响及其机制尚不十分清楚。 肝纤维化是肝硬化发展的必经阶段，而肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)激活又是肝纤维化的中枢事件。激活的HSC过度分泌胶原蛋白，造成细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)大量增生沉积，最终导致肝纤维化和肝硬化。而抑制HSC活化，减少活化的HSC数量能有效缓解肝纤维化的发生发展。因此，诱导和促进活化的HSC凋亡是治疗肝纤维化的策略之一。 研究目的: 为进一步了解MSC的旁分泌物质对肝纤维化的作用，本实验以活化的肝星状细胞系Lx-2为研究对象，通过MSC与Lx-2 Transwell共培养，了解培养上清中MSC旁分泌物质对Lx-2的影响并探讨其机制。 研究方法: 采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymalstem cell，BM-MSC)，并将其与人肝星状细胞系Lx-2 Transwell共培养组作为实验组，单独培养的Lx-2作为对照组，研究各组中MSC旁分泌物质对Lx-2的作用。采用流式细胞术及Hoechst33342染色法分别检测Lx-2细胞凋亡的情况，qRT-PCR和Western Blot检测Lx-2中解耦联蛋白2(Uncoupling protein2，UCP2)的mRNA和蛋白水平的表达量，荧光探针法检测Lx-2细胞内及线粒体中活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的荧光强度，脂质过氧化物试剂盒检测细胞培养上清中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量。 研究结果: 1、流式细胞术和Hoeehst33342染色法示:与对照组相比，实验组Lx-2细胞凋亡增多，可见染色质固缩、颗粒状荧光等凋亡细胞典型表现，凋亡率是对照组的2.6倍，两组差异具有统计学意义; 2、qRT-PCR和Western Blot检测示:实验组Lx-2中UCP2的蛋白表达量降低，对照组UCP2 mRNA的表达量是实验组的2.16倍，两组相比P值小于0.05; 3、细胞免疫荧光和脂质过氧化物检测示:实验组Lx-2细胞内和线粒体中ROS水平明显升高，细胞培养上清中MDA的含量是对照组的2.5倍左右，两组相比P值小于0.05。 结论: 1、MSC旁分泌物质有诱导Lx-2细胞凋亡的作用; 2、此作用可能与MSC旁分泌物质抑制UCP2的表达，促进细胞内及线粒体ROS过量生成有关。

目录

声明

英文缩略词

摘要

前言

材料和方法

一、材料

二、方法

结果

1、人骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

2、人肝脏星状细胞系的培养

4、细胞凋亡检测

5、Lx-2细胞中UCP2表达量的变化

6、细胞ROS检测

7、细胞培养上清液MDA检测

讨论

结论

参考文献

文献综述 间充质干细胞治疗肝脏疾病的新进展

攻读硕士学位期间论文发表情况

致谢