大颗粒淋巴细胞白血病发病机制探讨和克隆性检测

摘要

第一部分STAT3突变和表达在T大颗粒淋巴细胞白血病中的意义 目的:T大颗粒淋巴细胞白血病(T-cell large granular lymphocytic leukemia，T-LGLL)是一种少见的细胞毒性T淋巴细胞增殖性疾病，常常合并自身免疫性疾病。信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)是一种癌基因，存在于胞浆并在激活后能够转入核内与DNA结合的蛋白，在许多肿瘤的发生中起着重要的作用。我们通过检测T-LGLL患者中STAT3突变以及表达情况，分析其与临床特征的关系，探讨其理论意义和临床价值。 方法:采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)联合DNA测序检测28例初诊T-LGLL患者的STAT3外显子20、21的基因序列;采用实时定量逆转录PCR技术、SYBR Green荧光染料法检测T-LGLL患者外周血单个核细胞及正常人单个核细胞中STAT3 mRNA表达水平，运用循环阈值(cycle threshold，Ct)比较法进行相对定量分析，上述基因的相对表达量以公式2(-△Ct)表示;评价STAT3突变状态和血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)的关系。SPSS16.0软件包进行统计学分析，以P＜0.05代表差异有统计学意义。 结果:28例T-LGLL患者STAT3突变率是21.4％。STAT3突变组和未突变组之间比较，性别、年龄、血清LDH水平、B症状(P=0.062)、淋巴细胞增多、贫血（P=0.057）、脾肿大和LGL计数无统计学差异。高β2-MG水平(P=0.005)、中性粒细胞减少(P=0.018)和纯红细胞再生障碍性贫血(pure red blood cell aplasia，PRCA)(P=0.001)和STAT3突变相关。单因素分析，无治疗生存时间(treatment-freesurvival, TFS)和STAT3(P=0.008)、贫血(P＜0.001)和β2-MG(P=0.006)相关。多因素分析，仅有贫血(P＜0.001)是较短TFS的独立的危险因素。 结论:STAT3突变T-LGLL患者常合并PRCA、中性粒细胞减少，β2-MG较高;STAT3突变、高β2-MG、贫血T-LGLL患者预后差。 第二部分T大颗粒淋巴细胞白血病克隆性研究:流式细胞术检测T细胞受体Vβ链和T细胞受体基因重排 目的:T-LGLL是一种少见的淋巴增殖性疾病，与反应性T-LGL淋巴细胞增多症的鉴别是一个难点，迄今为止，尚没有同时应用流式细胞术检测T细胞受体Vβ链(flow cytometric variableβ-chain repertoire，FC-Vβ)和T细胞受体基因重排(T-cell receptor gene rearrangement，TCR-GR)来区分T-LGLL和反应T-LGL淋巴细胞增多症相关研究。我们同时使用FC-Vβ和TCR-GR检测T细胞克隆性，探讨这两种方法对T-LGLL诊断价值， 方法:抽取50例T-LGLL患者的外周血或者骨髓，采用流式细胞术检测TCR-Vβ;提取T-LGLL患者的外周血或者骨髓样本的DNA，BIOMED-2多重聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)联合异源双链分析或者基因扫描检测TCR基因重排，同时检测18例反应性T-LGL增多症作为对照，比较检测结果。采用SPSS16.0软件包进行统计学分析，组间比较采用(x)2检验或者Fisher确切概率法，两组以上比较采用方差分析，以P＜0.05代表差异有统计学意义。 结果:在所有T-LGLL患者中，FC-Vβ检测均为阳性;在克隆性评价中，FC-Vβ和基因扫描有着相同的敏感性和特异性;FC-Vβ检测克隆性的敏感性高于异源双链分析;联合评价2个TCR靶点(TCRβ和TCRγ)可以较好的证明T细胞的克隆性。 结论:在T-LGLL的诊断中，FC-Vβ分析是一种快速方便的方法;使用BIOMED-2引物系统进行基因扫描和异源双链分析TCR重排都是敏感和特异的方法，联合使用2种方法是最佳的评价方法;BIOMED-2多重PCR和FC-Vβ对T-LGLL克隆性的检测，具有很好的一致性。 第三部分KIR对侵袭性NK细胞白血病诊断价值 目的:侵袭性NK细胞白血病(aggressive natural killer cell leukemia，ANKL)是一种少见的大颗粒淋巴细胞白血病，需要和NK淋巴细胞增殖性疾病(NKlymphoproliferative disorder，NK-LPD)相鉴别。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killercell immunoglobulin-like receptors，KIR)表达提示NK克隆性。为了对ANKL的临床特征有更好的了解和用流式细胞术分析KIR表达模式来检测NK克隆性，我们在ANKL患者中进行了前瞻性的研究。 方法:用实时定量PCR检测外周血单个核细胞EBV DNA拷贝数;用R显带的方法对16例ANKL患者进行细胞遗传学分析;抽取患者的外周血或者骨髓，采用流式细胞术检测KIR;提取患者的外周血或者骨髓样本的DNA，BIOMED-2多重聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)联合基因扫描检测TCR基因重排;采用PCR联合DNA测序检测ANKL患者的STAT3外显子20、21的基因序列。采用SPSS16.0软件包进行统计学分析，组间比较采用x2检验或者Fisher确切概率法，两组以上比较采用方差分析，以P＜0.05代表差异有统计学意义。 结果:共有36例ANKL患者纳入分析。所有的患者都有B症状(100％)，最常见的症状是发热(100％)。患者的体能状态(performance status，PS)通常较差，噬血细胞综合征(hemophagocytic syndrome，HPS)常见(80.6％)。89.7％的患者EBV(Epstein-Barr virus，EBV) DNA阳性(＞5000拷贝数/ml)，患者初诊时外周血单个核细胞EBV DNA含量从7.0×103～1.6×108拷贝数/ml。24例患者均为KIR克隆性表达或者表达缺失，其中克隆性表达患者7例，表达缺失的患者17例。23例患者接受化疗，其中10例对治疗有反应(38％)。单因素分析，EBV-DNA的阳性率(P=0.015)、PS＞2(P＜0.001)、HPS(P=0.001)、胸腹腔积液(P=0.017)、血小板减少(P=0.021)、淋巴细胞增多(P＜0.001)和中性粒细胞减少(P=0.003)是早期死亡的不良预后因素。有治疗反应(P＜0.001)、CD56阴性(P=0.035)和接受化疗(P=0.038)的患者具有较好的预后。 结论:ANKL具有异常的免疫表型特征和克隆性KIR表达，KIR检测对ANKL有重要的诊断价值;ANKL预后极差，早期诊断、合理的化疗方案和异基因造血干细胞移植可能改善患者的预后。

目录

声明

摘要

引言

参考文献

第一部分 STAT3突变和表达在T大颗粒淋巴细胞白血病中的意义

1．前言

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

参考文献

第二部分 T大颗粒淋巴细胞白血病克隆性研究：流式细胞术检测T细胞受体Vβ链和T细胞受体基因重排

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

参考文献

第三部分 KIR对侵袭性NK细胞白血病诊断价值

1．前言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

参考文献

附录1 英文缩写表

附录2 攻读学位期间发表论文情况

综述 大颗粒淋巴细胞白血病和JAK／STAT信号通路

致谢