NGAL噬菌体单链抗体的筛选、表达及其在免疫胶体金检测方法中的初步应用

摘要

人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程密切相关，是新的早期肾损伤生化标志物。本研究旨在应用噬菌体展示技术筛选NGAL特异性抗体，并建立免疫胶体金检测技术，为体内NGAL变化水平的检测提供方法，为急性肾损伤的诊断提供帮助。
　　本论文采用免疫的Balb/C小鼠，从其脾脏中提取总RNA，以反转录的cDNA为模板，通过设计的简并引物来扩增轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，经过重叠延伸PCR方法连接为单链抗体基因(scFv)。经sfiⅠ、XbaⅠ双酶切后连接到噬菌体载体pCantab5E中，转化大肠杆菌TG1成功构建了库容为5×107 pfu的鼠源噬菌体抗体库。经过PCR检测，抗体库的插入率为85％。随机挑取部分单克隆测序分析发现抗体重链和轻链可变区序列均不相同，说明了本研究构建的鼠源噬菌体抗体库多样性较好。
　　以重组蛋白NGAL作为靶蛋白对噬菌体抗体库进行了四轮富集，从第四轮筛选后的抗性平板上挑取了30个单克隆进行了噬菌体抗体ELISA鉴定，将阳性克隆构建CHO细胞表达载体，转染到CHO细胞中并进行压力筛选、重组表达，对表达纯化后的抗体进行了SDS-PAGE、ELISA效价及亲和力分析。结果表明，单克隆有11个为强阳性。ELISA测定抗体效价为1∶107，抗体亲和力为6.532×10-9 M。表明本论文成功获得了NGAL基因工程抗体，为NGAL检测诊断方法的建立提供了物质基础。
　　应用重组表达的抗体与实验室制备的多抗，建立了NGAL免疫胶体金检测方法。确定了免疫胶体金层析方法最优条件:金标抗体标记量12μg/mL，金标抗体的稳定剂为0.08％的PEG-20000，金标抗体的保存液为20 mM pH8.2硼酸缓冲液(含0.01％ Na2N3、0.08％PEG-20000);结合垫处理液为20 mM pH9.0 Tris-HCl(含0.5％PVP-40、0.5％Trion)、样品垫处理液为0.01 mol/L pH7.4 TBS(含1％ BSA、0.05％ Tween20)、金标抗体喷涂量为0.5μL/mL、羊抗NGAL抗体喷涂量为1.2μg/mL、羊抗人的IgG喷涂量为4μg/mL。将试纸条分别置于37℃及4℃密封干燥避光保存，到第20周其敏感性和特异性均没有降低。使用该试纸条对40份临床样本进行了检测，结果与临床检测结果完全一致。上述结果表明，本论文建立的免疫胶体金检测方法的稳定性、特异性较高，在临床样品检测上有较高的价值。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 NGAL简介

1．2 基因工程抗体简介

1．2．1 基因工作抗体的种类

1．2．2 基因工程抗体的表达系统

1．3 噬菌体抗体库技术及其应用的研究进展

1．3．1 噬茵体抗体库技术的优点

1．3．2 噬菌体抗体的分类

1．3．3 目标抗体的筛选与表达

1．3．4 噬菌体抗体库技术应用的研究进展

1．4 免疫胶体金技术概述

1．4．1 免疫胶体金技术的基本原理

1．4．2 免疫胶体金技术的优点

1．5 本研究的目的和意义

第二章 NGAL噬菌体抗体库的构建

2．1 引言

2．2 试剂与仪器

2．2．1 实验试剂及材料

2．2．2 实验仪器

2．3 试验方法

2．3．1 BALB／c鼠免疫

2．3．2 小鼠脾脏总RNA提取

2．3．3 反转录合成cDNA

2．3．4 PCR扩增小鼠抗体轻链、重链基因

2．3．5 ScFv的PCR扩增

2．3．6 ScFv基因与载体pCantab5E酶切

2．3．7 抗体基因SCFv与载体pCantab5E连接

2．3．8 连接产物电击转化

2．3．9 噬菌体抗体库重组率鉴定和多样性分析

2．4 试验结果

2．4．1 NGAL蛋白免疫小鼠血清效价测定

2．4．2 小鼠脾脏RNA提取

2．4．3 小鼠抗体VH和VLPCR扩增

2．4．4 ScFv基因PCR拼接

2．4．5 NGAL小鼠噬菌体抗体库库容

2．4．6 噬菌体抗体库的插入率及多样性分析

2．5 本章小结

第三章 NGAL噬菌体抗体库的筛选及抗体表达

3．1 引言

3．2 试剂与仪器

3．2．1 实验试剂及材料

3．2．2 实验仪器

3．3 试验方法

3．3．1 噬菌体表面展示抗体库的制备

3．3．2 NGAL噬菌体抗体库的筛选

3．3．3 ELISA鉴定重组噬菌体单克隆

3．3．4 阳性克隆序列分析

3．3．5 重组抗体真核表达载体构建

3．3．6 表达质粒转化CHO细胞

3．3．7 双抗夹心ELISA方法检测重组抗体的表达

3．3．8 重组抗体的纯化

3．3．9 纯化抗体的SDS-PAGE鉴定

3．3．10 ELISA鉴定纯化后抗体活性

3．3．11 亲和力测定

3．4 试验结果

3．4．1 NGAL噬菌体抗体库的富集

3．4．2 噬菌体单克隆鉴定

3．4．3 噬菌体抗体基因序列

3．4．4 抗体基因表达载体构建

3．4．5 ELISA鉴定细胞表达上清

3．4．6 纯化抗体SDS-PAGE鉴定

3．4．7 纯化抗体的活性鉴定

3．4．8 纯化抗体的活性鉴定

3．5 本章小结

第四章 NGAL基因工程抗体在免疫胶体金检测方法中的应用

4．1 引言

4．2 试剂与仪器

4．2．1 实验试剂及材料

4．2．2 实验仪器

4．3 试验方法

4．3．1 金标抗体的制备与纯化

4．3．2 结合垫、样品垫的预处理

4．3．3 金垫的制备及抗体喷涂

4．3．4 免疫胶体金测试条的组装

4．3．5 免疫胶体金层析法各种最佳条件的选择

4．3．6 测试方法与评判

4．3．7 特异性试验

4．3．8 稳定性试验

4．3．9 对临床样品的检测

4．4 试验结果

4．4．1 免疫胶体金层析法各种最佳条件的选择

4．4．2 特异性试验

4．4．3 稳定性试验

4．4．4 对临床样品的检测

4．5 本章小结

第五章 总结和展望

5．1 总结

5．2 展望

参考文献

硕士期间发表论文

致谢