端粒长度及其相关遗传变异与胃癌发病风险的分子流行病学研究

摘要

胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类健康。我国是全球胃癌疾病负担最重的国家之一，阐明胃癌发生相关影响因素，提高胃癌的防治水平具有重要的公共卫生意义。胃癌的发生是一个复杂的多阶段癌变过程，受到环境因素和遗传因素的共同作用。幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori，HP)感染、N-亚硝基化合物、多环芳烃化合物、盐腌食品、烟草和酒精暴露等因素已被证明是影响胃癌发病的主要环境因素，而拥有不同遗传背景的个体之间被证明存在胃癌的易感性差异。由于肿瘤发生机制的高度复杂性和广泛异质性，胃癌的病因及其相关机制尚未完全阐明，仍需开展深入的研究和探索。端粒(Telomere)是线性染色体末端由TTAGGG六个碱基串联重复序列构成的一种特殊保护性结构，在维持染色体的完整性和基因组稳定性方面具有极其重要的作用。在正常体细胞复制的过程中，端粒随着每一次复制而进行性缩短。因此，端粒长度可以在一定程度上反映机体在细胞水平的衰老程度，也具有成为能反映肿瘤等衰老相关疾病发生风险标志的巨大潜力。目前很多研究对端粒长度进行检测以研究其与疾病的关系。尽管组织来源的细胞相比于外周血白细胞可以为研究端粒长度与特定疾病关系提供更直接的证据，但由于外周血样本更加容易获取且对于被研究者的创伤小，且不同组织间端粒长度存在高度的相关性，使得外周血成为研究端粒长度最主要的替代组织。本研究分为两个部分：
　　第一部分：端粒长度与胃癌发病风险的病例-对照研究。端粒异常导致基因组不稳定是肿瘤发生重要的标志性分子事件。流行病学研究已经对端粒长度与一些常见肿瘤发病风险的关系进行了深入探讨。对于胃癌也有少量研究涉及，但这些研究不仅样本量较小而且结论也不一致。例如，Liu等研究者对来自中国人群的396例胃癌病例和378例健康对照的端粒长度进行检测和分析后发现，较短的端粒长度可显著增加胃癌的风险(OR=2.14，95％CI:1.52-2.93)，而在一项来自欧洲人群的前瞻性研究却没有发现端粒长度与胃癌发病风险的相关性风险比为1.04(95％CI:0.77-1.39)。因此，鉴于已有胃癌相关研究的不一致结论，本研究采用大样本病例对照设计研究外周血相对端粒长度与胃癌发病风险的关系。病例为江苏地区医院来源的1，136例新发胃癌病例，对照样本为来源于江苏地区社区慢病筛查人群的1，012例健康个体。采用定量PCR方法检测端粒长度，利用特异性引物分别扩增同一个体外周血基因组DNA中端粒序列的拷贝数(Telomere，T)和单拷贝基因序列拷贝数(Single copy gene，S)，通过端粒序列和单拷贝基因序列拷贝数的比值(T/S)来定量相对端粒长度(Relative telomere length，RTL)。采用盲法、复孔平行设置和重复检测等质量控制措施以保证端粒长度检测的准确性。采用Logistic回归模型分析不同端粒长度等级（按照对照样本端粒长度的三分位数、四分位数和五分位数将病例对照全部样本端粒长度进行分组）个体的胃癌发病风险，计算OR值和95％可信区间。用限制性立方样条函数Logistic回归模型分析端粒长度与胃癌发病风险之间的剂量反应关系。研究结果显示，端粒长度与年龄和性别显著相关，高龄组（中位数:1.39，四分位数间距:1.08-1.68）低于低龄组(1.58，1.32-1.93，P＜0.001)，男性(1.46，1.17-1.75)低于女性（1.58，1.24-1.94，P＜0.001）。胃癌组的平均端粒长度(1.28，0.94-1.69)显著低于对照组(1.49，1.20-1.80，P＜0.001)。限制性立方样条函数分析显示，端粒长度与胃癌发病风险呈显著“U”型关系(P＜0.001)。将研究对象以对照组端粒长度的五分位数进行分组，与第四分位数组相比，第五（端粒最长）、第三、第二和第一分位数组（端粒最短）胃癌的发病风险均增加，OR值(95％CI)依次为1.78(1.30-2.44)、1.28（0.93-1.77）、1.65（1.21-2.26）和3.81(2.82-5.13)。研究表明，端粒长度与胃癌发病风险呈现非线性的“U”型关系，端粒过长或过短均增加胃癌发病风险。本研究首次发现了端粒长度与胃癌风险这一复杂关系，研究结果将为揭示端粒在胃癌发生中的作用以及深入阐明胃癌的病因提供了重要线索。
　　第二部分：端粒长度全基因组关联研究：近年来，应用全基因组关联研究(Genome-wide association study，GWAS)方法研究表型相关的遗传位点已成为国际研究热点。多篇欧洲人群GWAS报道了端粒长度与基因组遗传变异的关系，发现了多个端粒长度相关的染色体区域和基因（3q26,TERC;4q32.2,NAF1;5p15.33,TERT10q24.33,OBFC1;20q13.3,RTEL1;2p16.2，ACYP2;19p12，ZNF208）。这些研究所取得的重要发现将为阐明影响欧洲人群端粒长度的遗传机制提供重要线索。但是，目前中国人群中端粒长度相关遗传变异的研究较少。Liu等研究者在中国人群中开展的一项GWAS研究报道了5p13.33（rs2736100，P=1.93×10-5）和12q13.13(rs17653722，P=6.96×10-6)区域的两个位点与端粒长度显著相关，并且其中rs2736100与欧洲人群研究报道的一致，但是这两个位点显著性水平均没有达到GWAS标准(P＜5×10-8)。鉴于目前影响中国人群端粒长度的遗传变异尚不明确，本研究开展了端粒长度GWAS，利用Affymetrix GeneChip Human Mapping6.0芯片和Illumina Omni中华芯片分别对来自常州社区慢病筛查队列的1，012例(GWASⅠ)和张家港社区健康体检人群的948例(GWASⅡ)研究对象外周血DNA样本进行全基因组基因分型，同时应用定量PCR方法检测所有样本的相对端粒长度，开展这两个人群的端粒长度GWAS研究，通过逆方差加权Meta对两个人群GWAS结果进行合并分析。并进一步利用Sequenom MassARRA平台在867例山东来源样本中验证初筛发现的潜在阳性端粒长度相关遗传变异。利用TaqMan7900基因分型平台在病例对照样本（1，136例病例和1，012例对照:同第一部分研究病例）中对我们GWAS发现的位点以及欧洲人群GWAS已报道端粒长度相关位点与胃癌发病风险的关系进行研究。遗传变异与端粒长度的相关性采用一般线性模型分析，遗传变异、端粒长度和遗传评分与胃癌发病风险的关系采用Logistic回归模型分析。研究结果显示，位于染色体9p24.1区域的遗传变异rs78744096在三个人群均与端粒长度相关(GWASⅠ:β=0.470，P=1.79×10-3; GWASⅡ:β=0.509，P=8.04×10-4;验证人群:β=0.145，P=0.038;三个人群合并后β=0.248，P=2.31×10-6)。在欧美人群端粒长度相关遗传变异的分析中发现，位于TERT基因第二内含子的遗传变异rs2736100与本研究人群端粒长度也存在相关性（β=-0.043，P=0.012）。将欧美人群发现的8个端粒长度相关遗传变异合并后与本研究人群端粒长度显著相关(P＜0.001)。本研究未发现已知的端粒长度相关遗传变异与胃癌发病风险存在显著关联。

目录

声明

摘要

序言

第一部分：端粒长度与胃癌发病风险的病例-对照研究

前言

对象与方法

结果

分析与讨论

第二部分：端粒长度全基因组关联研究

前言

对象与方法

结果

分析与讨论

总结

参考文献

附录

发表论文

综述 端粒长度与肿瘤发生风险的研究进展

致谢