利用CRISPR/Cas9技术构建ApoE-/-猪模型

摘要

心脑血管疾病是全世界主要的致死性疾病，动脉粥样硬化是其重要的病理基础。高脂血症和高胆固醇血症被认为是动脉粥样硬化发病及发展的重要因素。载脂蛋白E(ApoE)在胆固醇和脂蛋白的转运和代谢中发挥重要作用。ApoE基因敲除小鼠的广泛应用，使得动脉粥样硬化早期病理机制的研究取得了很大进展。但ApoE敲除小鼠与人类在动脉粥样硬化病理机制上相去甚远。猪因为在解剖学和生理上和人类似，适合于建立动脉粥样硬化大动物模型。
　　目的:通过敲除猪的ApoE基因，建立国际上首批ApoE基因敲除猪，培育动脉粥样硬化的猪模型，能更好地研究动脉粥样硬化的发病机理，同时为进一步研究动脉粥样硬化的预防治疗打下基础。
　　方法:设计合适的ApoE基因敲除的CRISPR/Cas9靶点，并组装CRISPR/Cas9打靶质粒;通过CRISPR/Cas9质粒与表达G418抗性的tdTomato质粒共转染猪胎儿成纤维细胞，经过抗性筛选和PCR产物测序的方式鉴定出ApoE基因双敲的单细胞克隆;以筛选获得的ApoE基因双敲的猪胎儿成纤维细胞单克隆作为体细胞核移植供体，通过体细胞核移植(SCNT)技术，构建国际上首例ApoE基因双敲的克隆猪。对于构建的克隆小猪，提取耳部组织基因组DNA后，PCR测序鉴定其ApoE的基因型。
　　结果:根据选取的ApoE靶点位置，设计并成功组装CRISPR/Cas9打靶质粒，CRISPR/Cas9质粒转染猪原代成纤维细胞，筛选得到ApoE等位基因双突变的中华小型猪单细胞克隆个数为14个，ApoE等位基因双突变的巴马猪单细胞克隆个数为27个。将CRISPR/Cas9筛选获得ApoE双敲突变细胞作为核移植供体，应用体细胞核移植技术，成功获得了17头ApoE敲除猪。
　　结论:应用CRISPR/Cas9系统，结合体细胞核移植技术可以一步成功构建ApoE纯合敲除猪模型。结果不仅证实了CRISPR/Cas9系统是构建基因改造猪的高效工具，而且还为利用ApoE基因敲除猪研究动脉粥样硬化的发病机理和预防治疗打下基础。

目录

声明

全文主要缩略语

摘要

前言

第一部分 ApoE敲除细胞的建立

1．实验仪器与材料

1．1 实验仪器

1．2 实验材料

1．3 实验试剂

1．4 试剂配制

2 实验方法与步骤

2．1 猪原代成纤维细胞(PFFs)分离

2．2 CRISPR／Cas9打靶质粒构建

2．3 打靶质粒转染猪原代成纤维细胞

2．4 ApoE基因打靶细胞克隆的筛选及鉴定

3 实验结果

4 分析与讨论

第二部分 ApoE基因敲除猪模型的建立和鉴定

1 实验仪器与材料

1．1 实验仪器

1．2 实验材料

1．3 实验试剂

1．4 试剂配制

2 实验方法与步骤

2．1 ApoE基因敲除猪模型的构建

2．2 ApoE基因敲除猪的鉴定

3 实验结果

分析与讨论

参考文献

综述 基因组编辑与体细胞核移植结合构建转基因大动物模型

攻读学位期间发表文章情况及科研工作情况

致谢