基于链特异性测序的肝癌HepG2细胞系lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的构建

摘要

对于肝癌发生发展的机制仍然缺乏一个系统的认识，特别是不同致病因素及其相互作用在肝癌的作用仍知之甚少，尚未确定的关键基因组或者分子异常表达对HCC诊断率提高或介入治疗的靶向性都有帮助。最近的数据表明，非编码RNA发现及功能研究表明其在肝癌的发生、发展、转移过程中扮演着非常重要的角色。深入研究非编码RNA在肝癌发生过程中的分子作用机制，从而筛选新的诊断标志物和治疗靶点成为当前肿瘤研究的热点。肿瘤坏死因子TNF-α主要是由脂多糖刺激巨噬细胞而分泌、具有多种生物活性的炎性细胞因子，与其他细胞因子共同作用，激活免疫反应，导致肿瘤坏死。本研究以HL-7702/HepG2作为实验目标并分为两个实验组，分别对其总RNA去后rRNA采用链特异性RNA测序技术，使用生物信息学方法获得mRNA/lncRNA表达谱数据，同时对于差异mRNA进行了功能注释，为研究lncRNA调控作用，使用DIANA-TarBase v7.0和lncBaseSoftware分别得到miRNA-mRNA、miRNA-lncRNA关系对，最终得到lncRNA-miRNA-mRNA三元互相调控网络。本论文试图分析在肝癌发生及TNF-α诱导过程中与其关联的miRNA、mRNA和lncRNA，构建lncRNA-miRNA-mRNA三元互相调控网络，从而筛选出特定mRNA/lncRNA作为肿瘤早期诊断标志物、恶性评估及预后判断指标，同时也为分子生物学机制提供一定的理论依据。本论文主要分为两部分:
　　1.培养HL-7702及HepG2细胞系，进行去核糖体链特异性建库测序，使用生物信息学方法进行数据质控、read比对、转录本组装等，采用FPKM的方法对表达水平进行归一化，筛选出具有显著差异表达的mRNA/lncRNA。共得到差异表达的mRNA3035个，其中上调表达1384个，下调表达1651个;显著差异表达的lncRNA有57个，其中上调的有23个，下调的有34个（筛选标准|log2 ratio|＞1，FDR＜0.01）。对于差异表达的mRNA进行了GO注释，发现了其中与细胞增殖和胞凋亡、死亡有关的共有23个，同时也发现4个与肿瘤发生相关的通路:ErbB、JAK-STAT、mTOR以及WNT signalingpathways，表明相关基因参与了上述生物学过程促进了肝癌的发生。结合实验室之前有miRNA相关研究，miRNA和lncRNA及mRNA都存在相互调控，我们采用DIANA TOOL生物信息学分析工具对差异表达lncRNA进行了lncRNA-miRNA-mRNA调控网络分析，最终得到转录后水平上非编码RNA在肝癌发生过程中的调控图。
　　2.培养HepG2细胞系，其中一组使用TNF-α处理3小时，然后对处理前后的细胞系进行去核糖体RNA链特异建库测序。采用第一部分相同的生物信息学分析策略，得到有显著差异表达的mRNA/lncRNA。发现差异表达的mRNA114个，其中上调102个，下调表达12个;差异lncRNA共发现差异表达的46个，其中上调38个，下调8个(|log2(fold-change)|＞1，q_value＜0.05）。对于差异表达的mRNA的功能注释发现，一些炎症因子IL6，IL1B、IL8参与到TNF-α介导的凋亡与癌症通路，同时也注意到NF-KB通路中NFKIBA，NFKB1，IKBKE等基因的变化，这些差异基因一起参与了TNF-α介导肿瘤细胞凋亡过程。结合实验室之前有miRNA相关研究，miRNA和lncRNA及mRNA都存在相互调控，所以对于差异表达lncRNA我们采用DIANA TOOL工具进行了lncRNA-miRNA-mRNA调控网络分析，得到转录后水平上三种RNA之间调控网络关系图。
　　本研究选取HL-7702和HepG2细胞系作为研究对象，其中一组HepG2细胞系使用TNF-α进行处理，希望获得肿瘤细胞增殖过程中以及TNF-α介导肿瘤细胞凋亡过程中的分子机制，得到在mRNA和非编码RNA层次上调控网络图，然而还需要更多的实验支持。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 高通量测序技术

1．1．2 lncRNA研究

1．1．3 TNF-α简介

1．2 研究内容及意义

1．3 论文组织结构

第二章 HL-7702／HepG2肝癌细胞lncRNA／mRNA表达谱

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 Trizol法Total RNA提取

2．2．3 总RNA样本质量检测

2．2．4 测序流程

2．2．5 mRNA／lncRNA测序数据质量分析

2．3 mRNA表达谱分析

2．3．1 表达差异归一化方法

2．3．2 数据筛选

2．3．3 mRNA功能注释

2．3．4 可变剪切分析

2．4 lncRNA表达谱

2．4．1 lncRNA统计分析

2．4．2 lncRNA-miRNA-mRNA调控网络

2．5 本章小结

第三章 TNF-α处理前后HepG2肝癌细胞mRNA／lncRNA表达谱

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 细胞培养

3．2．2 总RNA样本质量检测

3．2．3 测序流程

3．2．4 mRNA／lncRNA测序数据质量分析

3．3 mRNA表达谱分析

3．3．1 mRNA表达差异基因

3．3．2 mRNA功能注释

3．3．3 可变剪切分析

3．4 lncRNA差异分析

3．4．1 lncRNA统计分析

3．4．2 lncRNA-miRNA-mRNA调控网络

3．5 本章小结

第四章 总结与展望

参考文献

附表

致谢

作者简介