染色体5p13.1区域遗传变异与胃体癌易感性的关联研究

摘要

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其年龄标化发病率和死亡率分别居我国恶性肿瘤的第2位和第3位，严重威胁着我国居民的生命健康，是亟需缓解的重大公共卫生问题。胃癌的发生是一个长期多阶段的过程，是环境因素与遗传因素复杂相互作用的结果。幽门螺杆菌感染是胃癌已知的致癌因素，全球超过50％的人感染幽门螺杆菌，但仅＜3％的感染者罹患胃癌，这说明不同个体对环境因素的反应存在不同的易感性。这种易感性主要受个体遗传因素的影响，筛检具有胃癌遗传易感性的高危人群，并采取针对性的预防措施，是有效控制胃癌高发的策略之一。随着高通量基因组检测技术的发展和应用，全基因组关联研究(Genome-wide Association Study，GWAS)已成为肿瘤等复杂性疾病遗传易感性研究的一种高效策略。近年来，针对中国、日本和韩国等胃癌高发国家人群开展了多项胃癌GWAS，发现染色体1q22、6p21.1、7p15.3、8q24.3和10q23等多个胃癌易感区域。本课题组前期开展了一项三阶段胃体癌GWAS，发现染色体3q13.31(rs9841504)和5p13.1(rs13361707)区域是中国人群胃体癌的遗传易感区域。这些新发现的胃癌易感性单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）位点将为高危人群筛检提供生物标志物。
　　本文针对胃癌易感位点的功能研究发现，位于染色体1q22区域MUC1第二外显子的rs4072037可通过控制该外显子5'端的选择性剪接而影响胃上皮细胞中MUC1的表达和生理功能;位于染色体8q24.3区域PSCA第一外显子的rs2294008T＞C可通过降低PSCA的转录活性，降低PSCA在胃癌壁细胞中的表达。GWAS发现的胃癌易感位点将为阐明胃癌发生机制提供新的线索，并为筛选胃癌潜在治疗靶标奠定基础。尽管胃癌GWAS发现了一些新的易感位点，但这些位点仅能解释一小部分的胃癌易感性。GWAS具有严格的统计检验水准，有效减少了假阳性的研究结果，但同时可能掩盖了大量易感区域。因此，基于已有GWAS数据进行深入分析有望进一步阐明胃癌遗传易感性。此外，目前除了对1q22和8q24.3区域开展了初步的机制研究，其它胃癌易感区域的生物学机制尚未揭示，需要开展进一步的研究阐明这些区域在胃癌形成过程中的作用。利用课题组已完成的胃体癌GWAS数据:采用Affymetrix6.0芯片对1033例胃体癌病例和2285例健康对照样本（565例病例和1162例对照来自江苏南京地区，468例病例和1123例对照来自北京地区）进行全基因组遗传变异检测。选取前期胃体癌GWAS尚未关注且符合以下标准的潜在胃癌关联性位点进行两阶段验证:1）南京和北京子研究关联方向一致的位点;2）排除前期GWAS已报道和已验证的位点及其高连锁不平衡(Linkage Disequilibrium，LD)位点(r2＞0.3);3)（总研究1.0×10-5＜P≤1.0×10-3，南京和北京子研究P≤0.01）或（总研究O≤1.0×10-5，南京或北京子研究其中一个P≤0.01、另一个0.01＜P≤0.05）的位点;4）基因分型图清晰的位点;5）高度连锁(r2＞0.8)位点中P值最低的位点。研究最终选择了11个遗传变异，先后采用两个独立人群进行验证:第一阶段为江苏来源的1154例胃体癌病例和1600例对照，采用Sequenom MassARRAY系统进行检测;第二阶段为武汉和北京来源的1687例胃体癌病例和904例对照，采用TaqMan方法对第一阶段验证阳性的位点（P≤0.05）进行基因分型。本研究采用logistic回归模型，相加遗传模型，调整年龄、性别、吸烟和饮酒情况计算各SNP与中国人群胃体癌的关联性OR值、OR值的95％置信区间和P值;分层分析中采用基于x2分布的Q检验进行异质性检验。
　　本研究对本课题组发现的胃癌易感位点进行了功能预测和实验验证:1）采用RegulomeDB1.1数据库对胃癌易感位点及其高LD（r2≥0.5）位点进行评分，选取1-3分的位点;2）在TFsearch1.3、Alibaba2.1和JASPAR5.0_ ALPHA三个数据库中进行碱基改变对转录因子结合能力改变的预测，选取预测结果一致的位点作为潜在功能性位点;3）构建重组质粒，在Hela、BGC-823和HGC-27细胞系中进行了双荧光素酶报告基因实验，采用t检验比较两重组质粒荧光素表达水平是否具有统计学差异，验证生物信息学的预测结果。研究发现，染色体5p13.1区域的rs6882769在GWAS初筛阶段[OR(95％CI):0.72(0.62-0.83)]和两轮验证阶段[第一阶段OR(95％CI):0.79(0.70-0.90);第二阶段OR(95％CI):0.81（0.71-0.93）]中均与胃体癌发生风险显著相关。合并三个阶段数据后发现，rs6882769 G等位基因可显著降低约20％的胃体癌发病风险[OR(95％CI):0.78(0.72-0.84)，P=2.15×10-10]。分层分析未发现这一关联在不同年龄、性别、吸烟和饮酒状况的人群中存在显著性差异。rs6882769与本课题组前期报道的rs13361707都位于染色体5p13.1区域，两者相距144kb并存在一定的LD关联(r2=0.249)。条件logistic分析发现，两位点是胃体癌相互独立的易感位点[GWAS阶段rs6882769: OR(95％CI):0.76(0.65-0.89),P=2.92×10-4; rs13361707: OR(95％CI):1.31(1.15-1.50)，P=3.12×10-5]，研究结果再次验证了染色体5p13.1区域是胃体癌的易感区域。为揭示染色体5p13.1区域易感位点的生物学功能，本研究对该区域的两个胃癌独立易感位点rs6882769和rs13361707及其高LD(r2＞0.5)位点进行生物信息学预测。预测结果显示与rs13361707完全连锁不平衡(r2=1.00)的rs59133000位于转录因子NF-κB(p65)的结合区域，该位点位于PRKAA1基因上游817bp，所在区域具有启动子转录活性。我们构建了PRKAA1上游含rs59133000不同等位基因序列的报告基因质粒，进行双荧光素酶报告基因实验。检测显示，在Hela、BGC-823和HGC-27三种细胞系中，含rs59133000 T等位基因质粒的荧光素表达水平均显著低于含rs59133000 C等位基因质粒的荧光素表达水平(P＜0.001)，提示rs59133000 T＞C可增强PRKAA1启动子的转录活性。本研究基于已有胃体癌GWAS数据进行独立人群验证，发现rs6882769是中国人群胃体癌的独立易感位点，进一步验证了染色体5p13.1区域是中国人群胃体癌的易感区域。研究还发现染色体5p13.1区域rs59133000 T＞C可增强PRKAA1的启动子转录活性，可能是该区域影响胃体癌发生的一个功能性遗传变异。本研究进一步揭示了中国人群胃癌的遗传易感性，为阐明5p13.1区域胃体癌致病位点机制提供了线索，并为促进该区域遗传变异作为生物标志物应用于胃癌高危人群早期筛查、早期防治提供了依据。

目录

声明

摘要

前言

对象与方法

一、研究对象和研究设计

二、研究方法

结果

1 研究对象的一般人口学特征

2 胃体癌易感性全基因组关联分析结果

3 胃体癌易感性两阶段验证结果

4 Imputation数据填补分析结果

5 分层分析结果

6 生物信息学预测发现rs59133000 T＞C可影响所在序列与NF-κB的结合能力

7 rs59133000 T＞C可影响所在区域的转录活性

讨论

总结

参考文献

综述 后GWAS时代疾病易感位点研究方法的进展

附录

发表论文

致谢