金纳米星SERS探针的构筑及其在细胞检测中的应用研究

摘要

拉曼光谱是一种无损光谱技术，具有指纹识别的特征，能在分子水平获得物质的结构信息。表面增强拉曼散射(SERS)主要是纳米尺度的粗糙表面所具有的异常光学增强现象，它可以将吸附在材料表面分子的拉曼信号放大102～106倍，与常规拉曼散射相比具有更高的检测灵敏度。SERS还具有稳定、不易猝灭、不受生物样品自身荧光及水的干扰等特点，非常适于生物样品的检测。金纳米星是一种由金属核和多个枝角构成的新型纳米材料，不仅在近红外区具有可调制的局域电磁场，而且尖锐枝角的“热点”(Hot Spots)极大地增强了周围电磁场的强度。本文基于金纳米星构筑了标记SERS探针(SERS tags)和无标记SERS探针(label-free SERS probes)，开展了细胞的SERS检测研究。
　　本研究主要内容包括：⑴采用种子介导生长法制备金纳米星，通过调节反应体系中氯金酸、对苯二酚以及金种子的比例，调控金纳米星的枝角长度和粒径。利用扫描电子显微镜(SEM)、紫外-可见-近红外(UV-vis-NIR)分光光度计和共聚焦拉曼光谱仪对金纳米星的形貌、光学性质和SERS效应进行了表征，优化反应条件，制得了形貌均一、单分散性好和SERS效应强的金纳米星。⑵以尼罗兰(NBA)和牛血清白蛋白(BSA)分别作为拉曼信号分子和保护层，制备了一种用于细胞成像的标记SERS探针。聚集实验和CCK-8细胞毒性分析验证了标记SERS探针具有很好稳定性及生物相容性。将标记SERS探针用于人肺腺癌细胞(A549)和人肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)的成像。结果表明标记SERS探针主要分布在细胞质，少量进入细胞核，负载标记SERS探针的细胞产生的拉曼信号强度远高于未负载的细胞。通过细胞的暗场成像、TEM验证了SERS成像的结果。⑶以对巯基苯甲酸(4-MBA)作为拉曼信号分子和表皮生长因子受体抗体(anti-EGFR)与金纳米星之间的偶联剂，构筑了一种具有细胞膜靶向功能的标记SERS探针。将标记SERS探针用于人正常肺上皮细胞(BEAS-2B)和人肺癌细胞(A549、H1229)的成像研究。A549细胞和H1229细胞产生SERS信号的强度明显强于BEAS-2B细胞，靶向到肺癌细胞上的SERS探针数量明显多于正常细胞。暗场成像与X射线能谱(EDS)分析验证了anti-EGFR偶联金纳米星成功富集到肺癌细胞表面。⑷将细胞膜穿透肽(TAT)连接到金纳米星表面，构筑了一种无标记SERS探针用于区分肺干细胞(LR-MSCs)的分化。评价了无标记SERS探针的稳定性、生物相容性及探针与细胞的相互作用。测得了LR-MSCs定向分化为肺泡上皮细胞(ATⅡ)或间质细胞(3T3)的平均SERS光谱。主成分分析(PCA)基于细胞SERS光谱很好地识别和区分了LR-MSCs的不同分化亚型。⑸基于TAT功能化无标记SERS探针，通过SERS表征了肺泡上皮细胞-间质转化(EMT)过程。免疫荧光和蛋白免疫印迹检测了EMT过程中上皮标志物和间质标志物的表达，验证了博来霉素(BLM)能够诱导ATⅡ细胞转化为3T3细胞。检测了EMT不同阶段细胞的SERS光谱，在EMT过程中，许多细胞组分的特征峰发生了明显的变化。PCA散点图表明EMT不同阶段的细胞被划分在四个不同的区域中，不同类型的细胞区分明显。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 选题背景

1．2 金纳米星研究概况

1．2．1 金纳米星的制备

1．2．2 金纳米星的光学性质及理论基础

1．2．3 金纳米星的应用

1．3 细胞SERS探针的构筑及应用

1．3．1 细胞SERS探针的构筑

1．3．2 SERS探针在细胞研究中的应用

1．4 论文研究目的和内容

参考文献

第二章 金纳米星的可控制备及SERS效应研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 材料与试剂

2．2．2 仪器与设备

2．2．3 金纳米星的制备

2．2．4 金纳米星的可控调节

2．2．5 金纳米星的SERS效应检测

2．2．6 表征

2．3 结果与讨论

2．3．1 金纳米星的光学性质和形貌表征

2．3．2 金纳米星形貌对SERS效应的影响

2．4 本章小结

参考文献

第三章 金纳米星的表面修饰及其生物相容性研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 材料与试剂

3．2．2 仪器与设备

3．2．3 金纳米星的制备

3．2．4 金纳米星的修饰

3．2．5 金纳米星修饰前后的稳定性研究

3．2．5 细胞培养及细胞实验

3．2．6 表征

3．2．7 统计分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 SERS探针的表征

3．3．2 金纳米星修饰前后的稳定性研究

3．3．3 标记SERS探针的细胞毒性检测

3．3．4 A549细胞与ATII细胞的暗场成像

3．3．5 A549细胞与ATII细胞的TEM成像

3．3．6 A549细胞与ATII细胞的EDS分析

3．3．7 A549细胞与ATII细胞的SERS成像

3．4 本章小结

参考文献

第四章 anti-EGFR偶联金纳米星SERS探针的构筑及其在肺癌细胞靶向识别中的应用

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 材料与试剂

4．2．2 仪器与设备

4．2．3 靶向SERS探针的制备

4．2．4 靶向SERS探针的稳定性分析

4．2．5 靶向SERS探针的细胞毒性检测

4．2．6 靶向SERS探针与细胞共培养

4．2．7 表征

4．2．8 统计分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 靶向SERS探针的表征

4．3．2 靶向SERS探针的稳定性分析

4．3．3 CCK-8细胞毒性检测

4．3．4 肺癌细胞与正常肺上皮细胞的暗场成像

4．3．5 肺癌细胞与正常细胞的EDS分析

4．3．6 肺癌细胞与正常细胞的SERS检测

4．4 本章小结

参考文献

第五章 TAT偶联金纳米星SERS探针的构筑及其用于区分肺干细胞的分化

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 材料与试剂

5．2．2 仪器与设备

5．2．3 仉姬功能化SERs探针的构筑

5．2．4 TAT功能化SERS探针的稳定性研究

5．2．5 细胞培养及细胞实验

5．2．6 表征

5．2．7 统计分析

5．3 结果与讨论

5．3．1 TAT功能化SERS探针的表征

5．3．2 TAT功能化SERS探针的稳定性研究

5．3．3 TAT功能化SERS探针对LR-MSCs毒性检测

5．3．4 TAT功能化SERS探针在LR-MSCs中内化

5．3．5 LR-MSCs分化的SERS检测

5．3．6 LR-MSCs分化的差谱分析

5．3．8 LR-MSCs细胞分化的PCA分析

5．4 本章小结

参考文献

第六章 TAT偶联金纳米星SERS探针用于检测肺泡上皮细胞-间质转化过程

6．1 引言

6．2 实验部分

6．2．1 材料与试剂

6．2．2 仪器与设备

6．2．3 TAT功能化SERS探针的制备及稳定性分析

6．2．4 细胞的培养及毒性检测

6．2．5 免疫荧光检测和蛋白免疫印迹分析

6．2．6 表征

6．2．7 统计分析

6．3 结果与讨论

6．3．1 TAT功能化SERS探针的制备及稳定性研究

6．3．2 TAT功能化SERS探针对ATII细胞毒性检测

6．3．3 TAT功能化SERS探针在ATII细胞中内化

6．3．4 EMT过程的SERS检测

6．3．5 EMT过程的差谱分析

6．3．6 EMT过程的PCA分析

6．3．7 EMT过程的生物学验证

6．4 本章小结

参考文献

第七章 总结与展望

博士期间研究成果

致谢